31个生物体FAD3蛋白的结构和系统进化1)

冯延芝 常德龙 王保平 于自力 赵阳 乔杰 王璐

(国家林业局泡桐研究开发中心，郑州，450003) (河南省国有孟州林场) (国家林业局泡桐研究开发中心)

ω-3脂肪酸是人体不能自身合成的必需脂肪酸，主要包括十八碳三烯酸(α-亚麻酸)、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，它具有促进大脑的发育(婴幼儿)、维持视力和免疫系统、调节血脂和血栓、降低心脏病风险以及抑制衰老等重要作用[1-4]。ω-3脂肪酸脱氢酶主要有FAD3、FAD7、FAD8三种，位于内质网中的FAD3仅催化亚油酸合成α-亚麻酸；位于质体中的FAD7和FAD8不仅可催化亚油酸合成α-亚麻酸，还可催化十六碳二烯酸合成十六碳三烯酸；这三种催化合成α-亚麻酸的关键酶，可直接影响ω-3脂肪酸的含量高低[5-7]。

研究表明，植物种子中的α-亚麻酸主要是由FAD3催化合成的[8]。目前，FAD3基因已从紫苏(Perillafrutescens)[2]、红花(Carthamustinctorius)[9]、花生(Arachishypogaea)[1]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[10]、亚麻荠(Camelinasativa)[11]、亚麻(Linumusitatissimum)[12]、毛白杨(Populustomentosa)[13]、麻疯树(Jatrophacurcas)[14]等多种植物中克隆得到。已有研究发现，转入大豆FAD3基因的水稻种子中，α-亚麻酸的量提高了10倍[15]；FAD3基因沉默后的烟草突变株中，α-亚麻酸的含量显著少于野生型烟草[16]；FAD3基因的过量表达，可提高番茄幼苗的耐盐胁迫能力[17]。上述研究表明，FAD3基因不仅可提高植物体内α-亚麻酸的含量，并可改良植物对非生物逆境胁迫的适应性[18-19]。

目前，虽对不同植物中FAD3的结构、功能等研究较多，但对不同生物体中FAD3蛋白的系统整理和综合比较分析较少。为此，本研究收集整理了31个生物体中35个FAD3蛋白的相关序列，并对其理化性质分析、多重序列比对和系统进化等进行了综合比较分析，为更深入研究植物体内α-亚麻酸合成、积累的调控机理以及定向遗传改良等提供参考。

1 材料与方法

FAD3是植物脂肪酸生物合成途径中的关键酶，主要催化亚油酸转化为亚麻酸，它首先在拟南芥突变体中发现[20]。本研究使用35个FAD3全长蛋白是利用拟南芥(Arabidopsisthaliana)FAD3的序列(登录号：NM_128552.4)，在NCBI的数据库中比对、检索到的，共来自31个生物体。本文中分析使用的FAD3蛋白名称、对应的物种以及GenBank登录号等详见表1。FAD3蛋白的简称，由植物拉丁名的首字母、GenBank中FAD3蛋白名称和登录号组成。

表1 FAD3蛋白的相关信息

注：Ⅰ为双子叶植物，Ⅱ为单子叶植物，Ⅲ为真菌。

利用网站ExPASy中的ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)，对35个FAD3蛋白质的氨基酸数量、相对分子质量、等电点、不稳定系数、酸(碱)性氨基酸残基等特性进行综合分析，后期利用Microsoft Excel完成数据处理。

利用软件Vector NTI Advance 11(Invitrogen)中AlignX程序的ClustalW算法，对35个FAD3蛋白质进行多重序列比对；该方法是依据氨基酸残基序列的相似性程度确定分数，相关参数均为软件默认值。

以热带假丝酵母(Candidatropicalis)作为外类群。首先利用MEGA 6.0软件中的Align对35个FAD3全长蛋白序列重新进行多序列比对；然后将比对结果两端的部分空白删除整齐备用；再使用MEGA 6.0软件Phylogeny中的邻接法(Neighbor-Joining)，构建35个FAD3全长蛋白序列的系统发育树。相关参数均为软件默认值，置信度用自举检验法检验，共设置1 000次循环，节点处的数字表示bootstrap值在1 000个循环中所占的百分比。

2 结果与分析

2.1 FAD3蛋白的理化性质

利用ExPASy网站的ProtParam tool对35个FAD3蛋白质进行理化性质分析。结果表明：不同植物中FAD3蛋白质的氨基酸序列差异不大，35个FAD3蛋白的平均长度为393±22个氨基酸残基，相对分子质量为45 047±2 259，理论等电点为8.09±0.78；FAD3蛋白质的不稳定系数为33.31±4.33，除油桐(Verniciafordii)和小麦(Triticumaestivum)外，其它33个FAD3蛋白均稳定；FAD3蛋白质的亲水性指数为-0.15±0.06，属于亲水性蛋白，并含有(8.51±0.69)%的酸性氨基酸残基、(9.10±0.70)%的碱性氨基酸残基。

2.2 FAD3蛋白的多序列比对

利用Vector NTI Advance 11多序列比对软件，对35个FAD3蛋白进行多序列比对分析(见图1)。由图1可见：无论是单子叶植物还是双子叶植物，其FAD3蛋白序列间均具有一定的保守性，其相似性达66.6%。其中，亚麻(Linumusitatissimum)[12]、播娘蒿(Descurainiasophia)[21]、紫苏(Perillafrutescens)[22]等α-亚麻酸含量较高的植物中，FAD3蛋白的相似性较高(达85.8%)；而拟南芥(Arabidopsisthaliana)[22]、油桐(Verniciafordii)[23]、白芥子(Sinapisalba)[24]等α-亚麻酸含量稍低的植物中，FAD3蛋白的相似性也较高(达97.4%)。初步推测，FAD3蛋白质的一级结构与其α-亚麻酸的含量关系密切。

第一行数字表示多序列比对的位点，背景颜色表示不同保守程度的氨基酸残基，其中保守性最高的是黄色，其次是蓝色、绿色，白色的保守性最低。

通过比对分析发现，35个蛋白序列中存在44个完全保守区域，共包含4种类型。除外类群CtFAD3-HM214545.1外，其它来自植物体的34个FAD3蛋白质中存在64个完全保守区域，包含7种类型，相似性达到71.9%；另外，还存在其它保守的氨基酸富集区，比如HH、PPF、YYR、VLGHDCGHGSFS等。由此可见，不同植物中FAD3蛋白在结构上具有一定的保守性(见表2)。

表2 FAD3蛋白质序列保守区及主要类型

注：CtFAD3-HM214545.1为热带假丝酵母的FAD3蛋白质，其它34个FAD3蛋白质所属的物种均为植物界。

2.3 FAD3蛋白的系统进化

以热带假丝酵母(Candidatropicalis)作为外类群，利用MEGA 6.0软件的邻接法构建35个FAD3蛋白质的系统发育树，所有参数均为软件默认值(见图2)。由图2可见：31个生物体的FAD3蛋白可分为3组，2种单子叶植物(小麦和水稻)单独聚为1组，其它32个来自双子叶植物的FAD3蛋白聚为1组，外类群热带假丝酵母单独为1组。单子叶植物与双子叶植物汇聚后，与外类群热带假丝酵母聚在同一进化树中。单子叶植物间的相似性为84.2%，双子叶植物间相似性为72.7%。大豆(Glycinemax)中3个FAD3蛋白的相似性虽高(98.2%)，但FAD3C并未与FAD3A、FAD3B聚为1支；杜仲(Eucommiaulmoides)、雷氏藻(Physariafendleri)中，2个FAD3蛋白的相似性分别为69.6%、85.8%，也未聚在一起。推测，植物中FAD3虽存在多拷贝的形式，但是其遗传距离和功能可能并不完全相同。

图2 不同物种FAD3蛋白质的系统发育

3 结论与讨论

本研究利用拟南芥FAD3蛋白序列(登录号：NM_128552.4)在NCBI上比对、搜索，获得31个生物体的35个FAD3全长蛋白，并对其进行了理化性质分析，其平均长度为393±22个氨基酸残基，相对分子质量为45 047±2 259，理论等电点为8.15±0.76，FAD3属于亲水性蛋白，除油桐(Verniciafordii)和小麦(Triticumaestivum)外，其它33个FAD3蛋白均稳定；多重序列比对分析结果表明，除外类群CtFAD3-HM214545.1外，其它来自植物体的34个FAD3蛋白的相似性达71.9%，并具有64个完全保守区域，包括HH、PPF、YYR和VLGHDCGHGSFS等多个保守的氨基酸富集区；系统进化结果表明，单子叶植物与双子叶植物虽均处在同一进化树中，但分界明显，且各聚为1支。

FAD3基因的表达具有时空性。FAD3基因在油用牡丹种子的不同发育过程中均有表达，但差异较大，在结实期10 d幼种中的表达量最高，20d次之[10]，FAD3基因在亚麻荠发育的种子中高水平表达[11]，FAD3基因在紫苏种子中的表达量远远高于根、茎、叶和花等其它组织器官[22]，预示着ω-3脂肪酸脱氢酶FAD3在上述植物种子α-亚麻酸合成和积累中发挥重要功能。植物体内α-亚麻酸含量的高低，不仅与FAD3基因的表达量有关，还与FAD3基因的拷贝数关系密切。研究表明，在富含α-亚麻酸的紫苏(Perillafrutescens)、杜仲(Eucommiaulmoides)、亚麻(Linumusitatissimum)等植物中，FAD3基因均存在多拷贝的形式[8，25-26]，而在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、小麦(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)等α-亚麻酸含量较低的植物中均为单拷贝[9]，M. Venegas-Calerón et al.[27]在向日葵中未分离到FAD3基因，推测其种子中微量的α-亚麻酸是由FAD7催化合成的。

Puttick et al.[28]研究发现，过表达FAD3基因，可使拟南芥种子中的α-亚麻酸含量由19%提高到39.6%；异位表达拟南芥FAD3基因也可提高大豆种子中α-亚麻酸的含量[29-30]；转入FAD3基因的烟草，不仅α-亚麻酸含量明显增加，且大大提高了对寒冷的耐受能力[31]；Zhou et al.[19]在白杨中过表达FAD3基因，其抗寒性得到显著提高；FAD3基因的过表达可显著提高番茄的耐寒和耐盐能力[17，32]。综上所述，通过遗传修饰上调FAD3基因的表达和酶活性，不仅可促进α-亚麻酸的富集，还可通过调节不饱和脂肪酸的含量改良植物对温度、盐害等逆境胁迫的适应性。植物体内ω-3脂肪酸脱氢酶FAD3的活性，除受到自身FAD3基因的表达调控外，还与其上下游基因间的网络调控、外界环境因子以及底物含量等之间的关系还有待于进一步深入探究。