LKB1在鼻咽癌中的表达及与化疗敏感性的关系*

张旭戈，周珊，傅少志，苗洪宾，刘彦婷，覃纲

（西南医科大学附属医院1.耳鼻咽喉头颈外科，2.肿瘤科，四川 泸州 646000）

多重耐药严重影响鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）患者的预后，寻找提高NPC化疗敏感性的靶点可能是提高其疗效的突破点。近年来，有文献报道肝激酶B1（liver kinase B1, LKB1）在肺癌等多种恶性肿瘤中突变或缺失，参与肿瘤的发生、发展及侵袭转移[1]，且其下游靶点腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）的激活可增加化疗药物的敏感性[2]，而LKB1在NPC组织中的表达及与化疗的研究则鲜有报道。本课题通过检测NPC组织中LKB1的表达水平，分析其与患者临床病理因素、预后及化疗敏感性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年3月—2016年8月在西南医科大学附属医院首次经组织活检确诊并治疗的NPC患者74例，收集各例患者的新鲜活检肿瘤组织和肿瘤组织石蜡块。其中，男性52例，女性22例；年龄21～77岁，中位年龄49岁。病理组织学分型：角化性鳞状细胞癌5例，非角化分化型癌31例，非角化未分化型癌38例。按照国际抗癌联盟（UICC）和美国癌症分期联合委员会（AJCC）第7版（2010）方案进行NPC的TNM分期，临床分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期9例，Ⅲ期48例，Ⅳ期14例。

1.1.1 纳入标准 ①所有患者术前未行放化疗，首次经本院病理科确诊为NPC并治疗；②未合并其他恶性肿瘤，具备完整的临床及病理资料；③石蜡切片质量佳，随访资料完整。本课题经本院医学伦理委员会批准，所有患者在术前签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人LKB1多克隆抗体（abs124916a，上海Absin生物科技有限公司），Envision免疫组织化学法检测试剂（K5007，丹麦Dako公司），氟尿嘧啶、奥沙利铂及环磷酰胺购自连云港市恒瑞医药公司，顺铂和卡铂购自济南市齐鲁制药有限公司，紫杉醇（北京协和药厂），多西他赛和吉西他滨购自连云港市豪森药业股份有限公司，ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术（ATP-TCA）试剂盒（北京金紫晶生物医药技术有限公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）；微孔板发光仪（北京滨松光子技术有限公司）。

1.3 免疫组织化学Envision二步法

取组织石蜡块，3μm厚切片，常规脱蜡，依次在EDTA修复液（pH=9.0）、柠檬酸盐修复液（pH=6.0）中高压抗原修复，3%甲醇H2O2去除内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）冲洗。依次滴加用PBS稀释为1∶200的兔抗人LKB1多克隆抗体，37℃孵育1 h；PBS冲洗，滴加二抗，37℃孵育30 min；PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗终止显色；流水冲洗，苏木精复染。严格按照试剂盒说明书进行操作。

LKB1染色为黄色或者棕黄色，所有切片在同一显微镜200倍视野下调整相同曝光强度、关闭自动白平衡功能，只调整焦距和视野，随机选取5个视野拍照；将Image Pro Plusversion 6.0（IPP）专业图像分析软件的灰度单位转换成光密度单位，测量切片的面积（area）、累积光密度 （integrated optical density, IOD），计算平均光密度值（mean optical density, MOD），进行半定量统计分析。MOD=总IOD/总area。

NPC中LKB1高、低表达分组：以所测NPC的MOD中位数为界限，小于中位数为低表达，大于或等于中位数为高表达。

1.4 化疗药物敏感实验

严格按照ATP-TCA试剂盒说明书进行操作。取部分新鲜活检标本消化重悬成单细胞悬液，调整密度为 2×105～ 4×105/ml，取100μl接种于 96孔培养板，加入抗肿瘤药物（实验组），每种药物设置5个测试浓度：200.0%、100.0%、50.0%、25.0%和12.5%PPC。PPC为根据待测药物的临床使用剂量所对应的血浆峰值浓度（peak plasma concentration, PPC）。2个对照组：不加任何抗肿瘤药物的对照组（M0）、加入最大ATP抑制剂的对照组（M1），将各组培养板置于37℃、5%二氧化碳CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养4～6 d，加入50μl/孔 ATP提取液，吹打混匀，再取50μl混合上清液置于对应的微孔板内，最后加入50μl/孔发光工作液，震荡检测。

1.4.1 评价标准 强敏感（SS）：IC50≤25% PPC和IC90≤100% PPC；中度敏感（IS）：IC50≤25%PPC 和 IC90＞100% PPC；轻度敏感（MS）：IC50＞25%PPC和IC90≤100% PPC；耐药R：IC50＞25% PPC和IC90＞100% PPC。IC50、IC90分别为抑制 50% 肿瘤细胞生长时的血浆峰值浓度和抑制90%肿瘤细胞生长时的血浆峰值浓度[3]。

1.5 随访

所有患者以门诊复查或回访电话的方式进行随访，随访截止时间2017年11月30日。无进展生存期为患者从确诊NPC后首次住院至确诊肿瘤进展、患者死亡或末次随访时的总时间。总生存期为患者从首次住院确诊为NPC至任何原因引起的死亡或末次随访的总时间。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NPC组织中LKB1的表达

免疫组织化学法结果显示，在LKB1高表达的NPC组织中，LKB1蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，呈棕黄色（见图1）。半定量统计分析结果表明，74例NPC患者中，LKB1蛋白的MOD中位数为0.146，LKB1低表达组与LKB1高表达组MOD比较，经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=10.180，P=0.000），LKB1 低表达组 MOD（0.122±0.019）低于LKB1高表达组的MOD（0.165±0.017）。见图2。

2.2 NPC患者LKB1表达水平与临床病理因素的关系

74例NPC组织中，LKB1高、低表达组患者性别、年龄、病理类型、T分期、N分期、M分期和临床分期比较，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者性别比较，经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05）。见附表。

图1 LKB1在NPC组织中的表达 （Envision二步法）

图2 NPC组织中不同LKB1表达组的MOD比较 （±s）

2.3 NPC组织对化疗药物的敏感性

74例NPC组织对氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、紫杉醇、环磷酰胺、吉西他滨、顺铂和多西他赛8种化疗药物的敏感性比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=47.226，P=0.000），NPC组织对卡铂的敏感性最高。见图3。

2.4 NPC组织LKB1表达水平与化疗药物耐药率的关系

LKB1低表达组与LKB1高表达组的环磷酰胺耐药率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.186，P=0.013），LKB1低表达组高于LKB1高表达组。其余7种化疗药物的耐药率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 4。

附表 NPC患者LKB1表达水平与临床病理因素的关系 [n =37，例（%）]

图3 NPC组织对化疗药物的敏感性比较

图4 NPC组织LKB1表达水平与化疗药物耐药率的关系

2.5 NPC组织LKB1表达水平与预后的关系

LKB1低表达组患者的转移和复发率（45.95%）与高表达组（40.54%）比较，经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.220，P=0.639）（见图 5）。LKB1低表达组的死亡率为40.54%，LKB1高表达组为18.92%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.140，P=0.042），LKB1低表达组高于高表达组（见图6）。

图5 两组患者的转移和复发率比较 （±s）

图6 两组患者的死亡率比较 （±s）

LKB1低表达组患者的无进展生存率与高表达组比较，经Log-rank χ2检验，差异无统计学意义（χ2=1.644，P=0.200）（见图7）。两组患者的总生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=5.385，P=0.020），LKB1低表达组低于高表达组（见图8）。

图7 两组患者的无进展生存率比较 （±s）

图8 两组患者的总生存率比较 （±s）

3 讨论

NPC是我国常见的头颈部恶性肿瘤之一，恶性程度高，早期易发生淋巴结转移。目前采用以放疗为主的综合治疗，放化疗与单纯放疗后的5年生存率分别为95%和86%[4-6]，故放化疗在多数治疗中可取得较好的疗效，并逐渐成为主要治疗方案[5]。但仍然存在治疗失败，其中对化疗药物的耐药是治疗失败的重要原因之一。因此，寻找增加化疗敏感性的标志物，对提高NPC的预后有重要的意义。

LKB1基因为一种抑癌基因，通过原位杂交技术检测发现几乎在人体的所有组织中有LKB1 mRNA的表达[6]。近年研究表明，LKB1在多种恶性肿瘤中存在缺失或突变，参与多种肿瘤的发生、发展及转归。LKB1/AMPK信号通路能调控肿瘤细胞的G1期，阻滞细胞周期，影响肿瘤细胞的生长[7]。有学者证实，激活AMPK的表达能够提高膀胱癌对化疗药物的敏感性[8]。在非小细胞肺癌中，LKB1通过下调mTOR等的表达，增加对化疗药物顺铂的敏感性[9]。与此类似，LKB1可促进卵巢癌细胞SIK1表达，明显抑制其细胞的生长、侵袭，促进细胞的凋亡。进一步研究发现，采用siRNA干扰技术敲除卵巢癌细胞中LKB1表达，能提高转化生长因子-β和EMT的表达，进一步降低卵巢癌细胞对化疗的敏感性；同样，构建重组质粒使LKB1过表达，能增加化疗敏感性，显著地抑制细胞的侵袭和转移[10]。然而，LKB1在NPC组织中的表达及与化疗敏感性关系的研究则鲜有报道。

本实验通过免疫组织化学法对74例NPC组织中LKB1的表达进行检测，发现LKB1蛋白在细胞核和细胞质中均有表达，LKB1高、低表达组间性别比较有差异，而两组其他临床因素比较无差异；LKB1低表达组的死亡率高于高表达组，LKB1低表达组的总生存率低于高表达组，但两组患者肿瘤复发和转移率、无进展生存率无差异。该结果与唐亮等[11]的研究不完全一致，可能是因为选择NPC标本的差异及随访时间不同等。本实验主要研究LKB1在NPC组织中高、低两组表达的情况，以及与临床因素、化疗药物敏感性及预后的关系。程忠强等[12]的研究证明，鼻咽黏膜慢性炎症组织中LKB1的表达水平高于NPC组织，所以本实验未选取鼻咽黏膜慢性炎症组织作为对照组。

本实验发现，74例NPC组织细胞对临床上常用的8种化疗药物（氟尿嘧啶、奥沙利铂、卡铂、紫杉醇、环磷酰胺、吉西他滨、顺铂和多西他赛）均敏感，其中对铂类化疗药物最敏感，与2017年NCCN指南中放化疗方案中常用铂类药物对应[13]。进一步将研究的NPC组织分成LKB1高、低表达组，比较两组间8种化疗药物敏感性的差异，发现LKB1表达差异只与环磷酰胺敏感性有关，与余下7种化疗药物无关，并且与LKB1高表达NPC患者比较，LKB1低表达NPC患者死亡率增加，总生存率降低，可能与LKB1调控及抑制化疗药物的敏感性有关。环磷酰胺是烷化剂类中的一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，不仅能作用于肿瘤细胞周期，调控细胞的凋亡，而且还能通过下调VEGF，参与抗血管生成的作用[14-15]。LKB1可通过激活AMPK，下调mTOR表达，抑制肿瘤细胞的增殖和生长[16]。而CEJKA等[17]研究发现，采用mTOR抑制剂依维莫司,可以增加化疗药物烷化剂环磷酰胺的敏感性。因此，推测低表达LKB1可能通过抑制AMPK/mTOR信号通路导致NPC对环磷酰胺耐药。LKB1能否作为临床上NPC患者提高环磷酰胺治疗敏感性的分子靶点及其具体机制，尚待进一步研究。

本实验通过检测LKB1蛋白在NPC中的表达，分析LKB1表达与NPC患者临床病理因素、化疗敏感性及预后的关系，初步证实LKB1在NPC中的低表达降低了患者总生存率，并导致对环磷酰胺耐药，但具体调节的机制有待进一步研究。