海带配子体采集过程中的污染防控

武瑞娜，罗世菊，赛 珊，赵聚萍，李晓捷，田萍萍，王伟伟

（1.山东东方海洋科技股份有限公司，山东 烟台 264003；2.国家海藻与海参工程技术研究中心，山东 烟台 264003；3.山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003）

海带是一种自然分布于北太平洋和北大西洋的冷水性大型经济食用海藻，自1927年从日本海域引入我国海域[1-2]之后，渐渐适应了我国的海洋环境条件，并发展成为重要的人工栽培经济海藻[3-6]。目前，我国的辽宁省、山东省、江苏省、浙江省、福建省和广东北部等沿海地区，为主要的海带养殖区域。

海带配子体是海带种质资源的最佳保存形式，也是海带进行杂交育种育苗及进一步研究分析的材料。海带配子体在生长过程中常会受到病原生物的危害，甚至导致配子体发病死亡[7]，细菌、真菌及杂藻污染是海带配子体克隆保存过程中需要解决的问题[8]。为了阻绝海带配子体采集过程中的污染源，该研究比较了紫外线照射和臭氧消毒对环境的消毒效果。

1 材料与方法

1.1 海带配子体采集前环境消毒

1.1.1 消毒方法 采用紫外灯消毒和臭氧消毒，选择功率适宜的紫外线灯管（30 W，3支），灯管距离地面约2 m，灯亮7～8 min开始计时，消毒时间分别设0.5 h和1.0 h。根据壁挂式臭氧发生器（烟台豪尔电器，HR-CF，3 g/h，80 W）操作规程使用，消毒时间分别设0.5 h和1.0 h，实验室20 m2。用平板自然沉降法于消毒前及消毒后不同时段采样培养统计菌落数。

1.1.2 空气菌落采样方法 将直径90 mm的营养琼脂培养皿，分别置于实验室的四角距墙壁1 m的位置和中央，距地面的高度为1 m，同时打开培养皿盖暴露30 min后，收集样本和空白培养平板置于35℃恒温箱中培养48 h，然后取出培养皿进行计数，2种消毒方法各进行10次重复试验及空气培养，分别统计培养平板上菌落数，最后得出实验室消毒前后空气中的菌落平均数，另外，同一试验空间利用不同消毒方式消毒试验时间差设为14 d，避免前后影响产生假象。

1.2 海带种菜消毒

剪取带有成熟孢子囊的种带块，每块大小约4 cm×4 cm。先用灭菌的脱脂棉蘸取煮沸冷却到10～15℃的海水进行擦洗，去除种带块表面的杂藻及其他附着物。擦洗好的种带块放在灭菌培养皿里进行实验。对照组采用传统采集方法（即擦洗好的种带块放到盛煮沸冷却海水的烧杯里直接放散）获得游孢子，游孢子附着成为胚孢子，胚孢子萌发后长成配子体。试验组进一步采用抽滤的1.5%KI（国药）和双抗（青霉素80 mg/L+链霉素0.1%）这两种消毒剂及二者联合使用在不同消毒时间组合处理后进行放散获得游孢子，游孢子附着成为胚孢子，胚孢子萌发后长成配子体。每块种带块采1个染色缸（含有4个载玻片），每组设6个平行。培养条件为：10℃，持续光照1 000 lx，营养盐NaNO3-N 10 g/m3、KH2PO4-P 1 g/m3，20 d 后镜检观察各组游孢子放散情况，统计游孢子附着率、胚孢子萌发率及采集染色缸的污染率。

消毒剂及处理时间分别为：1.5%KI分别处理10、15、20 min；双抗（青霉素 80 mg/L+链霉素0.1%）分别处理 10、15、20 min；1.5%KI处理 10min+双抗处理 10 min；1.5%KI处理 15 min+双抗处理 15 min；1.5%KI处理20 min+双抗处理20 min；然后各组再用煮沸冷却抽滤海水浸泡5 min，分别进行放散附着。

1.3 海带配子体分离

选用最佳处理方式处理过的种带放在抽滤的消毒海水里放散，获得游孢子后移入培养箱中培养20 d左右进行单配子体分离。

在彻底消毒的超净工作台内，用微毛细吸管在显微镜下分别挑选单个的、色素、状态较好的♀、♂配子体到5 mm×5 mm的小盖玻片上，及时进行镜检观察挑取的克隆状态，检查是否是单个并分好♀、♂，然后用灭菌的镊子将镜检合格的玻片转移到盛有抽滤海水培养液的试管里，用灭菌的脱脂棉封口，贴上标签，标签上要注明♀、♂配子体的编号及分离日期，20支试管为一扎，用橡皮筋困好后，再用一张15 cm×15 cm的锡箔纸做一个锡纸盖盖在上面，放入温度8～12℃、持续光照1 000～1 500 lx的光照培养箱内进行培养，营养盐NaNO3-N 10 g/m3、KH2PO4-P 1 g/m3，约45 d更换1次培养液。

2 试验结果

2.1 海带配子体采集分离前环境消毒方法效果的比较

利用这2种方法消毒的实验室其室内菌落数显著减少。臭氧消毒1 h杀菌率可达99.2%，利用紫外线消毒1 h杀菌率仅达87.4%，臭氧消毒明显比紫外线消毒效果好（表1）。

表1 2种消毒方法及不同消毒时间对室内菌落数的影响

2.2 海带种带消毒方法比较

对照组的种带块未使用消毒剂进一步处理，其游孢子的附着率和胚孢子的萌发率都是最高的，但采集染色缸的污染率也是最高的，试验组随着处理时间的延长，游孢子的活性明显减弱，附着率下降，且在长时间处理过程中种带孢子囊会过度放散，致使采集密度过低，即使无污染，也不适合作为种带处理的方法，所以1.5%KI+双抗海水20 min+20 min的组合不可取。综合考虑游孢子附着率、胚孢子萌发率和采集染色缸的污染率得出结论：1.5%KI15 min+双抗海水15 min的组合最佳（表2）。

表2 不同消毒处理方法的比较

图1 海带配子体采集

2.3 海带配子体防污染分离

选用1.5%KI 15 min+双抗海水15 min的组合处理过的种带块置于抽滤的消毒海水里放散，可以采集到无污染的海带游孢子（图1-A）。游孢子附着成为胚孢子后萌发，在培养箱中培养20 d左右胚孢子发育成配子体（图1-B）。这时可以利用微吸管分离法进行配子体分离，获得无污染的单配子体克隆（图1-C），通过试管保存在10℃、1 000 lx持续光照的培养箱中（图1-D）培养。在配子体分离过程中，要对实验室环境、超净工作台、显微镜、试管、微吸管、脱脂棉、锡箔纸等进行严格消毒，并严格遵守无菌操作，才能有效达到污染防控目的。

3 讨论

紫外线空气消毒法，作为一种较传统的空气消毒方法[9]，作用原理主要通过对病菌微生物的辐射损伤和对核酸的破坏功能使微生物致死，以达到消毒的目的。利用臭氧机进行室内空气消毒，是近几年新兴的一种消毒方法，臭氧可以杀灭细菌真菌及其细菌繁殖体、芽孢等，杀菌谱较广。该研究结果显示，采用臭氧机消毒法明显比紫外线消毒法效果好，臭氧消毒1 h室内基本可达到无菌的效果，所以臭氧消毒法应是实验室环境消毒的常用方法，在无人的状态下开启臭氧机1 h，即可达到消毒目的。

对种带的消毒处理首先要考虑种带的正常放散及游孢子的活性，该文选取了两种消毒剂及其联合使用在不同的时间组合下对种带块进行消毒处理实验，结果显示常规擦洗种带块后，用抽滤的1.5%KI海水溶液浸泡15 min，然后用双抗（青霉素80 mg/L+链霉素0.1%）溶液浸泡15 min为最佳的处理方法。最后用抽滤的相对无菌海水浸泡5 min，再转到装有75～100 mL抽滤海水的250 mL蓝盖瓶里等待放散。此方案污染防控效果最佳，且胚孢子的萌发率也相对较高。

选用最佳处理方式处理好种带后放散获得无污染的游孢子，附着后继续培养20 d左右利用微吸管进行单配子体分离，获得无雌雄混杂、无污染、单个的配子体，从源头上控制了污染菌的机会，大大提高了配子体克隆的成活率，基本可以达到相对无菌的目的，从而可以延长换水周期，节约人力物力。