五味保肝丸对酒精性肝损伤小鼠的保护作用及机制研究

杨青，于爽，孙晶，徐志龙，谢旭善，张伟

(青岛市海慈医疗集团，山东 青岛 266033)

酒精性肝损伤是由于长期饮酒所引起的肝脏疾病，发病率逐年升高，是仅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1]。目前，酒精性肝病的发病机制尚不明确，而且临床用药的治疗效果并不理想。五味保肝丸(降酶丸)是青岛市海慈医疗集团传统的中药自制制剂品种(鲁药制ZBZ1077)，由五味子、丹参、山楂等五味中药组成，具有敛阴、活血、降酶的功效，用于乙型肝炎、转氨酶升高等病症的治疗，效果显著。本院对五味保肝丸的前期研究表明，该制剂能够在一定程度上减轻CCl4所致的大鼠急性肝损伤，改善肝功能[2]。为了进一步探讨五味保肝丸的降酶保肝作用，本文观察了五味保肝丸对酒精性肝损伤小鼠的保护作用以及对肝微粒CYP450以及CYP2E1活性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂

五味保肝丸(青岛市海慈医疗集团制剂室)；红星二锅头白酒(北京红星股份有限公司生产，酒精度56%)；ALT、AST试剂盒(南京建成生物研究所)； BCA试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；兔抗小鼠CYP2E1抗体、β-actin抗体、HRP标记的羊抗兔IgG抗体(南京巴傲得生物科技有限公司)。

1.1.2 实验动物

健康昆明种小鼠，雄性，体重18～20 g，共50只，购自青岛市实验动物和动物实验中心。

1.1.3 实验仪器

7020型全自动生化分析仪(日本日立公司)；MK3型酶标仪(上海赛默生物科技有限公司)；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆机(江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂)；凝胶垂直电泳、蛋白转印装置、凝胶成像系统(美国伯乐生命医学产品有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及各组处理

将50只小鼠随机分成正常对照组、模型组和五味保肝丸低、中、高3个剂量组，每组10只。正常对照组和模型组给予羧甲基纤维素钠溶液，五味保肝丸低、中、高3个剂量组分别给予0.125、0.25、0.5 g/(kg·d)的五味保肝丸混悬液。每日灌胃给药1次。给药2 h后，正常对照组灌胃给予生理盐水，其余组灌胃给予白酒(12 mL/kg)，每天一次，连续10 d。末次给药后，小鼠自由饮水、禁食24 h后眼眶静脉丛采血1 mL于离心管，静置30 min，4 500 r/min离心，分离血清。取血后，将小鼠脱臼处死，迅速开腹，取出肝脏。

1.2.2 血清生化指标的测定

按照生化测定试剂盒说明书，对小鼠血清ALT、AST含量进行检测。

1.2.3 小鼠肝微粒体CYP450的含量测定

式中，Y为CYP450含量， nmol/mg；A为450 nm、 490 nm波长测定值；E为CYP450的毫摩尔消光系数，91 cm2/mmol；C为稀释后微粒体悬液蛋白质量浓度， mg/mL；r为比色杯光径长度， cm。

1.2.4 Western Blot法检测小鼠肝组织CYP2E1的表达

1.3 数据处理

实验数据均采用x±s表示，用SPSS 11.0软件进行分析，组间比较采用t检验，各组间数据比较采用方差分析，P<0.05 表示有显著性差异。

2 结果

2.1 五味保肝丸对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST含量的影响

与正常对照组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST含量显著升高，表明酒精性肝损伤模型造模成功。五味保肝丸低、中、高剂量组均能降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST含量，与模型组比较，差异具有统计学意义。见表1。

2.2 五味保肝丸对酒精性肝损伤小鼠肝微粒CYP450含量的影响

模型组与正常对照组相比，肝组织中肝微粒CYP450含量显著下降。与模型组相比，五味保肝丸三个剂量组均能升高小鼠肝组织中肝微粒CYP450，且呈剂量依赖性关系，其中，五味保肝丸中、高剂量组与模型组相比，差异具有统计学意义。见表2。

2.3 五味保肝丸对酒精性肝损伤小鼠肝微粒体CYP2E1含量的影响

采用Western Blot检测小鼠肝微粒体CYP2E1含量的变化，结果如图1所示。小鼠灌胃给予白酒后，肝微粒体CYP2E1表达显著增强，而五味保肝丸低、中、高剂量组与模型组相比，均能够抑制肝微粒体CYP2E1的异常活化，且随着五味保肝丸剂量增加，效果增强，提示五味保肝丸能够抑制酒精诱导的CYP2E1表达升高。

表1 各组小鼠血清ALT、AST含量比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

表2 各组小鼠肝微粒体CYP450含量比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

1正常对照组； 2 模型组； 3 五味保肝丸低剂量组； 4 五味保肝丸中剂量组； 5 五味保肝丸高剂量组。图1 五味保肝丸对酒精性肝损伤小鼠肝微粒体CYP2E1含量的影响Fig.1 Effect of WBW on liver microsomal CYP2E1 content in mice with alcoholic liver injury

3 讨论

肝脏是机体重要的代谢器官，各种因素引起的肝损伤都会导致肝细胞变性、坏死或凋亡，引发后续的炎症和纤维化病变，表现为脂肪肝、肝硬化、肝癌等疾病。酒精性肝损伤的发病机制尚未明确，中医认为其病理基础为肝血瘀阻，常以疏肝清热、活血祛瘀为主要治疗原则[5]。现代医学研究表明，酒精性肝损伤与乙醇及其代谢产物乙醛引起的肝毒性、代谢障碍、氧化应激、免疫反应等多种因素有关[6-7]。

细胞色素P450(CYP450)酶系是由许多同工酶组成的微粒体混合功能氧化酶，参与多种生理性物质、毒性致癌物以及约90%常用药物的代谢和转化。肝脏CYP450的酶活性下降会导致肝脏解毒能力降低，肝脏损害增加。CYP450基因和表型存在高度多态性，在药物代谢作用中, 最重要的亚型有CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1等[8]。

CYP2E1是CYP450的重要亚型，约占CYP450总量的7%[9]，乙醇是CYP2E1诱导剂，可诱导增加乙醛的产生，加速自由基生成，加重氧化损伤，代谢产物如丙二醛能够诱导炎性细胞因子的表达，加重酒精性肝损伤[10-11]。实验结果表明，不同剂量五味保肝丸能够抑制ALT、AST水平的升高，抑制肝微粒体CYP2E1的异常活化，但明显提高肝微粒体CYP450的酶活性，这可能是由于五味保肝丸能够作用于肝微粒体CYP450酶系中的其他亚型，诱导其酶活性增加，从而引起肝微粒体CYP450总酶活性增加，增强肝脏解毒能力。

综上所述，五味保肝丸对小鼠酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能是通过调节脂质代谢，减轻氧化损伤，抑制肝微粒体CYP2E1的异常活化，升高肝微粒体细胞色素P450水平，增强肝脏的解毒能力，发挥保肝降酶的作用。该研究为五味保肝丸的临床合理用药及药物联合应用提供了进一步的理论依据。