胰岛素样生长因子-1对全脑缺血大鼠学习记忆能力的影响

李永莉 赵 婧 刘黎明 张全波 刘 利 吴碧华

1.川北医学院附属医院老年科，四川南充 637000；2.川北医学院附属医院儿科，四川南充 637000

随着人口老龄化的加剧，脑缺血导致的血管性认知功能障碍（VCI）的发病率和死亡率逐渐提高，VCI患者生活能力和社会功能严重降低，已经给家庭和社会造成沉重的负担[1]。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）在中枢神经系统中分布广泛，是一种作用于神经的非选择性营养因子，能够促进神经细胞的生长发育，并调控其功能[2-3]。IGF-1水平与认知障碍相关[4-5]。IGF-1与对应受体结合后，通过PI3K/AKT信号通路将信号传入核内，导致相应神经元功能和结构的改变[6]。本研究采用四血管阻断法建立大鼠的全脑缺血模型，再分别给予IGF-1、IGF-1+PPP（IGF-1受体阻断剂）进行干预，探讨IGF-1改善全脑缺血大鼠学习记忆能力的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar雄性大鼠110只[川北医学院实验动物中心提供，实验动物合格证号为SCXK（川）2013-18]，体重约300 g，8~10周龄。大鼠饲养间自然光照，温度20℃，相对湿度45%~75%，饮食不限。采用简单随机分组，将110只Wistar雄性大鼠分为正常组、假手术组、全脑缺血模型组、模型给药组1及模型给药组2，正常组和假手术组各10只，全脑缺血模型组、模型给药组1及模型给药组2各30只。本研究经川北医学院附属医院实验动物伦理委员会批准同意。

1.2 侧脑室置管术

腹腔内注射10%水合氯醛麻醉后颅骨中线备皮。将大鼠固定在脑立体定位仪上，根据Paxions等[7]的脑立体定位图谱在颅骨上定位，并安置固定螺钉。在脑立体定位仪上固定微量注射导管，垂直埋设导管（硬膜下4.5 mm左右处）并固定，最后缝合创面。

1.3 全脑缺血模型的建立及给药干预

1.3.1 全脑缺血造模方法 侧脑室置管术后第6天建立全脑缺血模型。以10%水合氯醛麻醉大鼠，在操作台上以俯卧位固定大鼠。按改良的Pulsinelli四血管法来建立全脑缺血的动物模型[8-9]。以自制烧灼器凝闭双侧椎动脉，再使气管两侧的颈总动脉游离并放置线系活结，把线缝合进切口。24 h后提起颈总动脉的放置系结，夹闭合双侧颈总动脉20 min。全脑缺血造模成功标准[10]：①大鼠双侧颈总动脉夹闭后1 min内意识丧失；②眼球逐渐变白，瞳孔散大，对光反射消失；③翻正反射消失，自主呼吸加快。

1.3.2 假手术组 手术过程除不结扎双侧颈总动脉外，其余同全脑缺血造模方法。

1.3.3 各组给药方法 全脑缺血模型组、模型给药组1、模型给药组2大鼠分别侧脑室注射生理盐水10 μL、IGF-1（0.2 μg/μL）10 μL、IGF-1+PPP（阻断剂 PPP 腹腔注射20 mg/kg，侧脑室注射IGF-1晚于腹腔注射30 min），1次/d，给药时间共7 d。假手术组大鼠侧脑室注射生理盐水10 μL。

1.4 Morris水迷宫试验

分组前，先进行水迷宫实验。采用定位航行和空间探索连续测试大鼠5 d，记录基础数据，并筛选游泳能力好、正常状态的大鼠。连续给药7 d后，再次行水迷宫实验测试各组大鼠，并收集相关数据。

1.5 HE染色和免疫组化试验

水迷宫试验后以10%水合氯醛麻醉大鼠，心脏输注新鲜4%多聚甲醛。手术剔除头骨，取出变硬的大脑，并将大脑浸泡在4%多聚甲醛中12 h使之固定。从大脑底部视交叉前等距切分厚度为2 mm的脑组织，常规固定；采用石蜡包埋，大脑组织的石蜡切片厚度约为 5 μm。

1.5.1 HE染色 对大脑组织的石蜡切片进行常规的HE染色，用光学显微镜放大400倍观察大鼠海马CA1区各神经细胞形态，并选择5个视野，拍片保存。

1.5.2 免疫组化测定 采用免疫组化方法处置大脑组织的石蜡切片，用光学显微镜放大400倍观察大鼠海马CA1区，并选择5个视野，拍片保存。每个标本选5个切片，图片采用Image Pro Plus 6.0处理，统计指标为IOD值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，方差齐并符合正态分布，组间比较采用SNK检验；方差齐不符合正态分布或，组间比较采用Krμskal-Wallis H秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫实验

各组大鼠造模前原平台象限游泳时间、跨跃平台次数、平均逃避潜伏期差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药后，与正常组比较，全脑缺血模型组和模型给药组1的原平台象限游泳时间、跨跃平台次数明显减少，平均逃避潜伏期显著增加（P＜0.05）；与全脑缺血模型组比较，模型给药组1的原平台象限游泳时间更长、跨跃平台次数更多（P＜0.05），平均逃避潜伏期更短（P＜0.05）；与模型给药组1比较，模型给药组2的原平台象限游泳时间更短、跨跃平台次数更少（P＜0.05），平均逃避潜伏期增加（P＜0.05）。 见表1。

2.2 HE染色

HE染色结果显示，全脑缺血模型组及模型给药组2大鼠海马CA1区锥体细胞异常，层次紊乱、细胞减少、排列稀疏，细胞核不规则，部分固缩。与全脑缺血模型组比较，模型给药组1海马CA1区细胞数增加，排列整齐均匀，结构较清晰。见图1。

表1 造模前和给药后各组大鼠水迷宫实验结果比较（±s）

表1 造模前和给药后各组大鼠水迷宫实验结果比较（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05；与全脑缺血模型组比较，#P<0.05；与模型给药组1比较，&P<0.05

组别正常组假手术组全脑缺血模型组模型给药组1模型给药组2造模前只数 跨跃平台次数（次）原平台象限游泳时间（s）平均逃避潜伏期（s）给药后只数 跨跃平台次数（次）原平台象限游泳时间（s）平均逃避潜伏期（s）10 10 30 30 30 2.9±1.2 3.6±1.4 3.1±1.0 3.3±1.1 3.4±1.0 26.5±2.7 27.8±2.2 26.9±2.3 26.5±2.2 26.6±1.7 46.8±3.5 44.0±3.8 45.3±3.2 44.8±3.0 44.1±3.0 10 7 11 10 11 3.7±1.6 3.9±0.7 1.3±0.6*2.3±1.0#1.1±0.7&29.0±2.2 28.4±4.6 11.8±2.2*19.1±2.1#11.6±2.6&31.2±3.3 32.4±2.5 52.1±5.0*41.7±3.6#51.1±2.2&

图1 各组大鼠海马CA1区HE染色结果（400×）

2.3 免疫组化

免疫组化结果显示，假手术组和正常组差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常组和假手术组比较，全脑缺血模型组的p-Akt、p-mTOR蛋白表达显著增加（P＜0.05）；与正常组、假手术组和全脑缺血模型组比较，模型给药组1的p-Akt、p-mTOR蛋白表达更高（P＜0.05）。与全脑缺血模型组比较，模型给药组2的p-Akt、p-mTOR蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型给药组1比较，模型给药组 2的p-Akt、pmTOR蛋白表达显著减少（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

3.1 IGF-1

IGF-1与脑缺血损伤呈现相关性[3]。郭义君等[11]指出，急性颅脑损伤患者血浆IGF-1水平明显降低，且与认知功能密切相关。褚忠海等[12]发现皮质下缺血性脑血管病患者血清IGF-1降低。吴至凤等[13]研究提示IGF-1水平低下可能是脑瘫儿童认知水平损害的原因。

表2 各组大鼠海马CA1区p-Akt、p-mTOR的IOD值（±s）

表2 各组大鼠海马CA1区p-Akt、p-mTOR的IOD值（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05；与假手术组比较，△P<0.05；与全脑缺血模型组比较，#P<0.05，与模型给药组1比较，&P<0.05

组别 只数 p-Akt p-mTOR正常组假手术组全脑缺血模型组模型给药组1模型给药组2 10 7 11 10 11 6458.70±243.60 5864.80±508.60 9058.60±214.86*△46549.50±756.50#8587.70±314.60&4101.20±115.50 4109.20±90.30 7022.10±63.50*△26828.60±1031.20#6981.00±295.80&

IGF-1可以通过血-脑屏障的IGF-1受体进入大脑，从而发挥作用[14]。经鼻、皮下和静脉等方式给予IGF-1有效。Rizk等[15]发现静脉给予IGF-1，可减少大鼠脑梗死面积，同时能改善神经元的凋亡。石广滨[16]研究显示IGF-1能够改善痴呆模型大鼠学习记忆能力，且小剂量改善效果比大剂量好。槐雅萍[17]在脑室置管7 d后，对C57BL/6小鼠行脑反复缺血再灌注手术，手前及术后24 h经侧脑室给予2 μL IGF-1，可以改善VaD小鼠的学习记忆能力。外源性IGF-1对改善血管性认知障碍大鼠学习记忆的作用及其相关机制鲜有报道。给药方式、剂量、持续时间等仍需要进一步的研究。本研究考虑到外周给药虽然能够透过血脑屏障，但能够到达脑组织中的具体浓度不明确，且不同大鼠之间可能存在个体差异，对实验结果存在影响，故仍然选择侧脑室置管进行侧脑室给药的方式。注射剂量选择小剂量，即 0.2 μg/μL，注射时间为连续7 d，初步探讨作外源性给予IGF-1的作用。HE染色和水迷宫结果提示，外源性的IGF-1能够改善海马CA1区细胞凋亡，明显提高全脑缺血再灌注大鼠的学习记忆能力，这一作用能够被其受体阻断剂抑制。

3.2 PI3K/AKT信号通路与血管性认知障碍

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3 kinase/Akt，PI3K/Akt）是一条参与细胞生长发育的重要信号转导通路[16]。PI3K是磷脂激酶激酶家族中的重要成员，具有蛋白激酶活性以及脂类激酶活性。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信号通路的主要信号分子。该通路被PI3K激活后，活化底物，从而对细胞的生长、发育、凋亡产生影响。全脑缺血或者是局灶性脑缺血以后，p-Akt（Ser473）增加，而总Akt的表达没有变化，提示缺血损伤的神经元存活与Akt的磷酸化相关，与总Akt的水平无相关性[18]。PI3-Akt通路可分成多条信号支流发挥其作用，其中雷帕霉素靶蛋白（mTor）是该通路下游非常重要的效应器。近年来，大量研究表明IGF-1通过mTor发挥作用，阻断mTor信号能够抑制体外的少突胶质细胞生长[19]。Yi等[20]的研究显示，缺血性大鼠磷酸化的p-mTor表达明显增加，而mTor水平不变，说明磷酸化的mTor在通过中发挥作用。所以本研究选择p-Akt和pmTor蛋白作为检测PI3K/Akt信号通路的指标。全脑缺血模型组大鼠p-Akt和p-mTor蛋白表达均显著性提高，与文献[18,20]相符。给予IGF-1后，成模大鼠学习记忆能力改善，p-Akt和p-mTor蛋白表达增加；加用IGF-1受体阻断剂后p-Akt和p-mTor蛋白表达与未给予IGF-1成模大鼠差异无统计学意义（P>0.05）。由此，推测外源性IGF-1可改善大鼠学习记忆能力，该作用可能与PI3K/Akt通路的激活，p-AKt和p-mTOR蛋白表达上调密切相关。