甘草次酸对银屑病患者角质形成细胞增殖、凋亡及miR⁃21表达的影响

郑瑀心 闵敏 朱子羽 杨晓红 曹毅 郑敏

310053杭州，浙江中医药大学（郑瑀心、朱子羽、杨晓红、曹毅）；江苏省常州市第一人民医院皮肤科（闵敏）；浙江大学医学院附属第二医院皮肤科（郑敏）

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是甘草甜素的主要活性代谢产物，对多种肿瘤如肝癌、肺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌及白血病等来源的肿瘤细胞具有广泛的抑制作用，并且对于正常体细胞的毒性较小［1⁃2］。银屑病是一种以表皮增殖和炎症为特征的红斑鳞屑性皮肤病。临床上，以甘草甜素为主要成分的复方甘草酸苷片是银屑病的辅助治疗药物，已经得到广泛应用，并取得了良好的临床效果。我们试图通过研究甘草次酸对银屑病患者角质形成细胞增殖、凋亡以及miR⁃21表达的影响，初步探讨其治疗作用机制，从而为临床上甘草次酸有效治疗银屑病提供实验依据，为银屑病防治药物的研发提供新的切入点。

材料与方法

一、材料与仪器

甘草次酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），角质形成细胞完全培养基（美国Life公司），MTS细胞增殖试剂盒（美国Promega公司），凋亡试剂盒、流式细胞仪（美国BD公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），SYBR荧光定量试剂盒（瑞士Roche公司），PCR仪（美国Bio⁃Rad公司），酶标仪（美国DYNEX公司）。

二、方法

1.银屑病患者角质形成细胞分离及原代培养：本研究经浙江大学医学院附属第二医院医学伦理委员会批准（IRB⁃2016⁃023）。2016年9月至2017年10月在浙江大学附属第二医院收集确诊为寻常性银屑病的患者15例，其中男9例，女6例，年龄（40.21±12.38）岁。自患者皮损部位获取皮肤标本，取材前患者均签署知情同意书。将皮损标本保存于0.5%分离酶中，4℃过夜消化后，于超净台中分离表皮和真皮，表皮置于0.25%胰酶溶液中，37℃温育10 min。以胎牛血清中止胰酶活性，吹打表皮，以200目滤网过滤角质形成细胞悬液，500×g离心5 min。弃上清液，加入10 ml角质形成细胞完全培养基，接种于75 cm2培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养［3⁃4］，隔天换液，传代2～3次后用于后续试验。

2.MTS检测甘草次酸对银屑病角质形成细胞增殖的影响：取银屑病角质形成细胞单细胞悬液，以1× 105个/ml的密度接种于 96孔板中，每孔100 μl。次日细胞贴壁后换培养液，待细胞融合度达90%时，根据前期预实验结果，即甘草次酸对角质形成细胞的半抑制浓度（IC50）约为6 mg/L，予不同质量浓度（1、2、4、8、10 mg/L）甘草次酸干预，对照组加入含有0.01%二甲基亚砜（DMSO）的培养基。每个浓度设5个复孔，继续培养24、48、72 h。行MTS细胞增殖实验时，先将96孔板中培养基弃净，设5个空白对照复孔，对照组、实验组及空白对照组每孔均添加 100 μl角质形成细胞培养基及20 μl MTS，于37℃、5%CO2环境下孵育。1～4 h后，用酶标仪于540 nm波长处检测各孔吸光度（A值）。

3.流式细胞仪检测甘草次酸对银屑病角质形成细胞凋亡的影响：取银屑病角质形成细胞以1×105/ml（500 μl/孔）种于6孔板，待细胞融合至90%时，予甘草次酸干预，使终浓度为1、2、4、8和10 mg/L，对照组加入含有0.01%DMSO的培养基。作用24 h后收集细胞。按照BD公司Annexin V/PE和7AAD双染细胞凋亡试剂盒说明书处理后，立即行流式细胞仪检测。实验重复3次。

4.实时荧光定量PCR检测银屑病角质形成细胞miR⁃21表达水平：取银屑病角质形成细胞以1×105/ml（500 μl/孔）种于6孔板，待细胞融合度达90%时，予甘草次酸干预，使终浓度为1、2、4 mg/L，对照组加入含有0.01%DMSO的培养基，作用24 h后，Trizol法提取总RNA。再取部分银屑病角质形成细胞以1×105/ml（500 μl/孔）按上述方法接种于6孔板，予2 mg/L甘草次酸干预，作用18、24及48 h后，采用Trizol法提取总RNA。用miRNA cDNA合成试剂盒进行逆转录。设计合成引物，miR⁃21上游引物 5′⁃ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA⁃3′，下游引物5′⁃TGGTGTCGTGGAGTCG⁃3′；U6上游引物 5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACA⁃3′，下游引物 5′⁃AACGCTTCACGAATTTGCGT⁃3′。采用荧光定量PCR反应体系试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作，扩增miR⁃21和U6基因。以U6为内参进行定量分析，用2⁃ΔΔCt表示miR⁃21的表达量。ΔΔCt=（实验组目的基因Ct-实验组内参基因Ct）-（对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct）。实验重复3次。

三、统计学分析

采用Graph Pad 6.0统计处理软件分析。常规进行方差齐性检验、正态性检验。计量资料实验数据以表示。采用单因素方差分析和重复测量的方差分析统计组间和组内差异，两两组间比较采用LSD检验；相关性用Pearson相关系数分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、甘草次酸抑制银屑病角质形成细胞的增殖

图1 甘草次酸对银屑病患者角质形成细胞增殖的影响

见图1。重复测量方差分析显示，各浓度甘草次酸对银屑病角质形成细胞体外增殖均有抑制作用，且抑制作用在不同时间点差异有统计学意义（F=2 294，P＜ 0.05），药物作用时间越长，抑制作用越强；不同浓度组间增殖抑制率差异也有统计学意义（F=752.7，P＜ 0.05），甘草次酸浓度越高，抑制作用越强；药物浓度与时间之间存在交互效应（F=45.46，P＜ 0.05）。

二、甘草次酸促进银屑病患者角质形成细胞凋亡

见图2。1、2、4、8、10 mg/L甘草次酸组与对照组间银屑病角质形成细胞凋亡率差异有统计学意义（F=59.50，P＜0.05）。两两比较显示，除1 mg/L甘草次酸组与对照组间差异无统计学意义外，其余各甘草次酸组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。甘草次酸浓度与银屑病角质形成细胞凋亡率之间呈正相关（r=0.922，P＜0.05）。

三、甘草次酸抑制银屑病角质形成细胞miR⁃21的表达

实时荧光定量PCR显示，银屑病角质形成细胞分别经1、2、4 mg/L甘草次酸作用24 h后，miR⁃21表达水平分别为0.24±0.04、0.22±0.07、0.17±0.05，与对照组（0.92±0.12）相比，差异有统计学意义（F=213.10，P＜ 0.05）；两两比较显示，1、2、4 mg/L甘草次酸组较对照组miR⁃21基因表达均显著降低（P＜ 0.01）。2 mg/L作用18、24、48 h时，miR⁃21表达水平分别为0.55±0.02、0.22±0.06、0.15±0.06，与对照组（0.98±0.02）相比，差异有统计学意义（F=238.10，P＜0.05）；与对照组比较，2 mg/L甘草次酸处理不同时间均可降低miR⁃21基因表达（P＜0.01），且甘草次酸干预时间与miR⁃21表达量之间呈负相关（r=-0.949，P＜0.05）。

讨 论

已有学者发现，甘草次酸可抑制HaCaT细胞的增殖［5］。本研究显示，甘草次酸还可明显抑制银屑病角质形成细胞的增殖，诱导细胞凋亡，且随着药物浓度增加，凋亡率升高。因此，我们推测甘草次酸可能通过诱导细胞凋亡，抑制银屑病患者角质形成细胞增殖。

图2 甘草次酸处理24 h后对银屑病角质形成细胞凋亡的影响 右上象限代表晚期凋亡细胞

近来，miR⁃21被发现在炎症、肿瘤性疾病中发挥重要作用。Ahmed等［6］发现，在皮肤原代角质形成细胞及HaCaT细胞中，miR⁃21通过抑制骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein）依赖的抑癌基因PTEN、PDCD4、TIMP3和TPM1等的表达促进细胞增殖与迁移。国外学者还发现，miR⁃21在银屑病患者皮损区角质形成细胞中高表达，提示其与增殖相关，在银屑病的发病机制中可能发挥重要作用［7⁃8］。我们既往研究发现，清热凉血方对外周血miR⁃21的下调可能是其治疗银屑病的作用机制之一［9］；紫草素可明显抑制表皮生长因子对HaCaT细胞的促增殖作用，其机制可能为通过抑制miR⁃21的表达，达到抑制HaCaT细胞增殖的作用［10］。而且，甘草次酸可以抑制HaCaT细胞miR⁃21的表达［11］。但是目前尚无甘草次酸对银屑病患者原代角质形成细胞miR⁃21表达作用的研究报道。我们采用实时荧光定量PCR检测发现，甘草次酸抑制银屑病患者角质形成细胞中miR⁃21的表达。既往研究提示，miR⁃21在银屑病皮损区高表达，且与细胞增殖相关［7，12］。因此我们推测，甘草次酸对银屑病患者角质形成细胞miR⁃21表达的抑制可能与其细胞增殖抑制效应相关。然而，既往研究提示，多种miRNA参与银屑病发病，如miR⁃31、miR⁃103等［8，13］，这些都是银屑病皮损区活跃的生物标记物，而本研究仅围绕miR⁃21展开部分研究，因此，有关甘草次酸在银屑病治疗中的作用机制仍有待进一步研究。

综上，本实验以甘草次酸作为干预因素，以银屑病患者角质形成细胞为研究对象，证明甘草次酸抑制银屑病患者角质形成细胞的增殖，并诱导其凋亡，此外，甘草次酸明显抑制了增殖相关标记物miR⁃21的表达，为甘草次酸制剂治疗银屑病提供了实验依据。