京尼平苷通过PI3K⁃Akt途径拮抗黑素细胞氧化损伤

鹿文静 赵煜 王克玉

266035青岛，山东大学齐鲁医院（青岛）皮肤科（鹿文静）；山东大学齐鲁医院皮肤科（赵煜、王克玉）

京尼平苷是一种环烯醚萜类化合物，具有抗炎［1⁃2］、抗血栓［3］、抵抗肝损伤［4］等多种药理活性。此外有多项研究显示，京尼平苷对氧化应激引起的多种细胞损伤有保护作用［5⁃7］，且此保护作用与PI3K⁃Akt信号通路的活化有关［6⁃7］。氧化应激损伤是白癜风发病的一个重要环节［8⁃10］。白癜风患者表皮中H2O2过量聚集［11］，高浓度 H2O2可氧化损伤核酸、蛋白质和脂质等，产生大量氧化产物，直接或间接引起黑素细胞突变或死亡［12］。目前尚无京尼平苷对黑素细胞氧化损伤作用方面的研究。为了探讨京尼平苷对黑素细胞的氧化损伤有无保护作用及其可能的机制，我们应用体外培养的人正常黑素细胞，以H2O2诱导氧化应激反应，观察京尼平苷对细胞生长状态及抗氧化酶系统的影响，并检测PI3K⁃Akt信号通路在其中的作用。

材料与方法

一、试剂和仪器

黑素细胞培养基（M254基础培养基）、人黑素细胞生长添加剂2（HMGS⁃2）、1%青霉素/链霉素、胰酶为美国Gibco公司产品；中性酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）抑制剂LY294002为美国Sigma公司产品。兔抗人β肌动蛋白、Akt、p⁃Akt、血红素加氧酶1（HO⁃1）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx⁃1）抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗均为美国Abcam公司产品。活性氧（ROS）检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST⁃8法）、过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒、RIPA裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）预制胶、BCA蛋白浓度测定试剂盒均为上海碧云天生物技术有限公司产品，ECL化学发光试剂盒来自美国Millipore公司产品。

二、实验方法

1.黑素细胞分离、培养和纯化：正常人表皮黑素细胞来源于山东大学齐鲁医院泌尿外科门诊行包皮环切术的健康青少年包皮，所有样本取材前均由供皮者监护人签署知情同意书。取包皮，聚维酮碘消毒3 min，PBS洗涤3次，去除皮下组织，将包皮剪成约0.5 cm×0.5 cm的小片，置于0.25%中性酶中，4℃放置过夜，分离表真皮。用0.25%胰酶37℃消化表皮10 min，吹打成细胞悬液，200目筛网过滤，PBS洗涤2次，接种至含100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素及1%HMGS⁃2的M254培养基中，37℃、5%CO2培养箱中常规培养，每3天更换培养液，10～14 d后待细胞长至80%融合时传代，取第2～4代表皮黑素细胞用于实验。

2.实验分组及处理：收集第2～4代对数生长期黑素细胞，培养24 h后分为6组。①对照组：在M254培养基中培养，不作任何处理；②京尼平苷组：参考文献［13⁃14］，首先选择62.5、125、250、500、1 000 μmol/L H2O2孵育黑素细胞约4 h，观察黑素细胞的增殖率，发现250 μmol/L H2O2能够明显抑制细胞增殖且又不至于细胞死亡过多，因此选用250 μmol/L H2O2用于后续实验。然后参考文献［5⁃6］选用5、25、125、625 μmol/L京尼平苷培养黑素细胞，发现细胞增殖率与对照组无明显差异，用5、25、125、625 μmol/L京尼平苷联合250 μmol/L H2O2培养黑素细胞，发现5、25 μmol/L京尼平苷组细胞增殖率与H2O2组无明显差异，125、625 μmol/L京尼平苷组细胞增殖率高于H2O2组，故选用125 μmol/L京尼平苷进行后续实验。用含125 μmol/L京尼平苷的M254培养基培养24 h，更换为M254培养基继续培养5 h；③LY294002组，细胞在M254培养基中培养24 h后，加入含 5 μmol/L LY294002的 M254培养基作用1 h，更换为M254培养基后继续培养4 h；④H2O2组：细胞在M254培养基中培养24 h，然后根据预实验结果，加入含250 μmol/L H2O2的M254培养基作用4 h，更换为M254培养基后继续培养1 h；⑤京尼平苷+H2O2组：用含125 μmol/L京尼平苷的M254培养基培养24 h，换液后加入含250 μmol/L H2O2的M254培养基作用4 h，更换为M254培养基后继续培养1 h；⑥京尼平苷+LY294002+H2O2组：用含125 μmol/L京尼平苷的M254培养基培养24 h后，换液，加入含5 μmol/L LY294002的M254培养基作用1 h，再次换液加入含250 μmol/L H2O2的M254培养基作用4 h。

3.MTT法检测细胞活性：将黑素细胞以5×103/孔接种至96孔板，按上述分组处理，每组5个复孔，并设空白组（不含细胞，仅有培养基）。经相应药物处理后，每孔加5 g/L MTT溶液10 μl，在培养箱中作用4 h后，弃上清液，每孔加100 μl DMSO，用酶标仪在570 nm波长处测定每孔吸光度（A值）。细胞增殖率（%）=（A含药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

4.Western印迹法检测p⁃Akt、Akt、HO⁃1和GPx⁃1蛋白水平：按上述分组处理黑素细胞，每组3个复孔。每孔加入100 μl RIPA裂解液裂解30 min，收集细胞后，4℃离心机12 000 r/min（离心半径7.7 cm）离心30 min。取上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液充分混匀，100 ℃变性10 min，每样本取 15 μl，SDS⁃PAGE（预制胶）上样，电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。取PVDF膜置于10%脱脂牛奶中封闭非特异性抗原2 h，分别加入兔抗人p⁃Akt（1∶1 000稀释）、Akt（1∶1 500稀释）、HO⁃1（1∶2 500稀释）、GPx⁃1（1∶1 000稀释）及β肌动蛋白单克隆抗体（1∶1 000稀释），4℃过夜，TBST洗脱3次后加入二抗（1∶1 000稀释）孵育2 h，暗室内ECL试剂盒显影。用目的条带p⁃Akt、Akt、HO⁃1、GPx⁃1与相应内参β肌动蛋白条带的灰度值比值表示蛋白相对表达水平。

5.SOD和CAT酶活性检测：细胞分组处理方法同上，收集蛋白，定量蛋白浓度。按照SOD活性检测试剂盒和CAT检测试剂盒说明书操作，分别通过检测A450值和A520值计算SOD酶和CAT酶活性。

6.ROS含量检测：将黑素细胞以5×104/孔接种在6孔板中，细胞分组方法同上。收集细胞后，PBS冲洗2遍，加入10 μmol/L荧光探针2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH⁃DA），在暗室中37℃孵育20 min，上流式细胞仪（美国BD公司）检测。以细胞荧光强度反映细胞ROS水平。

7.统计学分析：应用SPSS 15.0统计软件分析。各指标数据以表示，均符合正态分布，单因素方差分析（ANOVA）进行多组间比较，SNK⁃q检验进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、京尼平苷降低H2O2对黑素细胞增殖活性的影响

MTT实验结果显示，京尼平苷组与对照组黑素细胞增殖率差异无统计学意义（q=0.6818，P＞0.05），而H2O2组显著低于对照组（q=10.06，P＜0.01）和京尼平苷 +H2O2组（q=9.378，P＜ 0.05）；京尼平苷+LY294002+H2O2组显著低于京尼平苷+H2O2组（q=5.822，P＜ 0.05），与H2O2组差异无统计学意义（q=1.257，P＞0.05）。见表1。

二、京尼平苷活化黑素细胞PI3K⁃Akt信号通路

与对照组相比，京尼平苷组黑素细胞Akt磷酸化水平（p⁃Akt/Akt）无明显变化（q=2.014，P＞0.05），而H2O2组则显著降低（q=6.486，P＜ 0.01）。京尼平苷+H2O2组p⁃Akt/Akt水平显著高于H2O2组（q=5.044，P＜0.05）和京尼平苷+LY294002+H2O2组（q=8.560，P＜0.01），而后两组差异无统计学意义（q=3.516，P＞ 0.05）。见表1，图1。

三、京尼平苷促进氧化应激下黑素细胞中HO⁃1、GPx⁃1的表达

H2O2组黑素细胞HO⁃1和GPx⁃1表达水平显著低于对照组（q值分别为4.580、4.388，均P＜0.05）和京尼平苷 +H2O2组（q值分别为5.282、6.265，均P＜0.01），京尼平苷+LY294002+H2O2组显著低于京尼平苷 +H2O2组（q值分别为4.064、6.618，P值分别 ＜ 0.05、＜ 0.01）。见表1，图2。

表1 京尼平苷对黑素细胞增殖率、SOD活性、CAT活性、ROS含量及p⁃Akt、血红素加氧酶1（HO⁃1）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx⁃1）蛋白表达水平的影响（）

表1 京尼平苷对黑素细胞增殖率、SOD活性、CAT活性、ROS含量及p⁃Akt、血红素加氧酶1（HO⁃1）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx⁃1）蛋白表达水平的影响（）

注：黑素细胞增殖率、SOD活性、CAT活性和ROS含量检测实验重复5次；p⁃Akt、HO⁃1、GPx⁃1蛋白水平检测实验重复3次，以目的条带与相应内参β肌动蛋白条带的灰度值比值表示蛋白表达水平。与对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与H2O2组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；与京尼平苷 +H2O2组比较，eP ＜ 0.05，fP ＜ 0.01。SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；ROS：活性氧

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图1 京尼平苷对黑素细胞p⁃Akt、Akt蛋白表达的影响 1：对照组；2：京尼平苷组；3：LY294002组；4：H2O2组；5：京尼平苷 +H2O2组；6：京尼平苷 +LY294002+H2O2组。H2O2组p⁃Akt蛋白表达明显低于对照组，京尼平苷+H2O2组p⁃Akt蛋白较H2O2组明显增加，而京尼平苷+LY294002+H2O2组较京尼平苷+H2O2组表达减少

四、京尼平苷提高氧化应激下黑素细胞SOD活性和CAT活性

与对照组比较，京尼平苷组黑素细胞SOD和CAT酶活性差异无统计学意义（均P＞0.05），H2O2组SOD和CAT活性则显著降低（q值分别为9.842、9.400，均P＜0.01）。京尼平苷+H2O2组SOD和CAT酶活性显著高于H2O2组（q值分别为5.033、5.929，均P＜0.05）和京尼平苷 +LY294002+H2O2组（q值分别为5.013、4.946，均P＜ 0.05）。见表1。

五、京尼平苷抑制氧化应激下黑素细胞内ROS的产生

京尼平苷组ROS含量与对照组相比差异无统计学意义（q=0.133，P＞ 0.05），H2O2组显著高于对照组（q=17.140，P＜ 0.01）和京尼平苷 +H2O2组（q=10.910，P＜0.01），京尼平苷 +LY294002+H2O2组显著高于京尼平苷 +H2O2组（q=5.048，P＜0.05），见表1。

图2 京尼平苷对黑素细胞血红素加氧酶1（HO⁃1）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx⁃1）蛋白表达的影响 1：对照组；2：京尼平苷组；3：LY294002组；4：H2O2组；5：京尼平苷 +H2O2组；6：京尼平苷 +LY294002+H2O2组。H2O2组的HO⁃1、GPx⁃1蛋白表达明显低于对照组，京尼平苷+H2O2组两种蛋白的表达均较H2O2组明显增加，而京尼平苷+LY294002+H2O2组则较京尼平苷+H2O2组表达减少

讨 论

近年研究发现，ROS所致的氧化应激反应是黑素细胞凋亡及黑素生成障碍的重要因素。已有大量研究证明，白癜风患者皮损及全身处于高氧化应激状态［15⁃17］，且抗氧化系统出现障碍［18］，氧化-抗氧化失衡，导致ROS过度聚集，攻击黑素细胞，干扰其正常代谢、功能和分化，诱发机体的自身免疫反应，造成表皮黑素细胞不可逆性损伤，导致白癜风患者皮肤和毛囊黑素细胞数量减少，引起局限性或泛发性皮肤色素脱失。

PI3K⁃Akt信号通路在细胞增殖、分化、凋亡及功能表达等方面发挥重要作用。本实验结果显示，H2O2诱导氧化应激后黑素细胞p⁃Akt减少，京尼平苷预培养可以提高氧化应激下黑素细胞Akt磷酸化水平，活化PI3K⁃Akt信号通路。黑素细胞PI3K和Akt活化后能够激活核因子NF⁃E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2⁃related factor 2，Nrf2），促使其转位到细胞核［19］，启动一系列抗氧化酶如HO⁃1［13⁃14］、SOD、CAT［14］、GPx［20］的表达。HO⁃1 属于微粒体酶系，是血红素分解代谢的限速酶，能够对黑素细胞氧化损伤起保护作用［21］。SOD能够通过催化超氧阴离子的岐化反应，将其转化为毒性更低的H2O2；而CAT和GPx⁃1能把H2O2分解为O2和H2O，从而保护细胞免受氧化应激损伤。Yin等［7］发现，京尼平苷能够通过活化PI3K上调海马神经元细胞中HO⁃1的表达，增强细胞抗氧化性。Wang等［22］在对小鼠急性酒精性肝损伤模型的研究中发现，京尼平苷可以提高SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的水平。上述研究说明，京尼平苷通过影响抗氧化酶发挥其抗氧化作用。本研究发现，H2O2诱导氧化应激后，HO⁃1和GPx⁃1蛋白表达下调，细胞内SOD和CAT活性降低，ROS含量显著增加，而京尼平苷可以改善H2O2对上述抗氧化酶的抑制作用，进而减少细胞内ROS含量，提高黑素细胞存活率。另外，京尼平苷对黑素细胞的氧化保护作用能够被PI3K抑制剂LY294002所抑制，说明京尼平苷通过PI3K⁃Akt信号通路发挥其抗氧化作用。

综上，本研究表明，京尼平苷能够通过PI3K⁃Akt途径上调抗氧化酶HO⁃1和GPx⁃1蛋白水平，增强SOD和CAT活性，从而提高黑素细胞的抗氧化能力，保护其免受氧化应激损伤，为京尼平苷用于防治白癜风提供实验依据和和研究方向。