原发免疫性血小板减少症患者外周血Th17细胞的检测及意义

李秀芹 张虎田

（东海县人民医院血液科 江苏 东海 222300）

原发免疫性血小板减少症（ITP）亦称特发性血小板减少性紫癜，是临床常见的出血性疾病，属于器官特异性自身免疫性疾病。ITP的发病机制未完全明了，传统观念认为机体体液免疫异常，B细胞产生大量抗血小板抗体介导血小板在单核吞噬细胞系统被破坏。然而越来越多的研究表明细胞免疫异常亦参与ITP的发病机制[1]。T细胞主要分为CD4+、CD8+T细胞，CD4+/CD8+T细胞平衡对维持机体的免疫稳定具有重要作用。Th17细胞是新发现的以高分泌IL-17为特征的CD4+T细胞亚群。研究表明Th17细胞在实验性脑脊髓膜炎、变应性胶原病及类风湿性关节炎中发挥重要作用[2,3]。关于Th17细胞在ITP中作用研究甚少。因此本实验通过检测ITP患者外周血T细胞亚群、Th17细胞的百分率，初步阐明其在ITP发病机制中的作用。

1.资料和方法

1.1 研究对象

30例ITP患者均为2016年3月—2018年8月来我院血液科就诊的住院和门诊患者，其中男10例，女20例，中位年龄35岁（12岁～78岁），诊断均符合张之南的《血液病的诊断与疗效标准》[4]。30例对照者为来我院体检的健康者，男10例，女20例，中位年龄36岁（13岁～80岁）。所有ITP患者的血小板计数均＜30×109/L，均数为：（8.05±6.79）×109/L。健康对照者血小板计数在（100～300）×109/L，均数为：（176.43±64.52）×109/L。

1.2 标本采集

所有ITP患者和对照者均空腹外周静脉采血1ml，肝素抗凝。

1.3 主要试剂和仪器

Anti-CD4-FITC、Anti-CD3-PerCP、Anti-CD8-PE均购自美国BD公司，Anti-IL-17A-Alexa Fluor647（Anti-IL-17A-AF647）购自美国BioLegend公司，无酚红RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，PMA、BFA购自美国Invitrogen公司，Ionomycin购自美国Sigma公司，固定剂、破膜剂购自AN DER GRUB公司，溶血素购自美国BD公司，1×PBS缓冲液为本实验室自配，FACS Calibur型流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.4 T细胞亚群检测

取一流式管加入Anti-CD4-FITC/Anti-CD3-PerCP/Anti-CD8-PE各2µl，再加入外周血100µl，避光孵育20min，加入1ml溶血素，避光溶血5min，1×PBS 2ml洗涤，离心（2000r/min，2min），共2次，弃上清，加200µl PBS，上机检测。

1.5 Th17细胞的检测

取一EP管加入新鲜肝素抗凝血100µl，无酚红RPMI1640培养基860µl混匀，再加入10µl PMA工作液，10µl Ionomycin工作液，20µl BFA工作液，体系中PMA、Ionomycin、BFA终质量浓度分别为50ng/ml、750ng/ml、10µl/ml。在37℃水浴箱中培养3h；将培养后的细胞悬液轻轻混匀取600µl，加入1个流式管中，离心（2000r/min，2min）；弃上清，振荡混匀，加入Anti-CD4-FITC 2µl，避光孵育15min；加100µl固定液，避光放置15min；加2ml 1×PBS洗涤，离心（2000r/min，2min）；弃上清，振荡混匀，加100µl破膜剂，避免震荡，轻轻混匀，避光5min；管中再加入2µl Anti-IL-17A-AF647，轻轻混匀，避光孵育15min；加2ml 1×PBS洗涤一次，离心（1500r/min，5min），弃上清，上机检测。

1.6 统计学分析

SPSS16.0统计软件对数据进行分析，数据符合正态分布用均数加减标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05具有统计学意义。

2.结果

2.1 ITP患者外周血T细胞亚群的分析

与健康对照组比较，ITP患者组CD3+T细胞百分率降低，但无统计学意义（P＞0.05）；CD4+T细胞百分率、CD4+/CD8+T细胞比率降低（P＜0.05）；CD8+T细胞百分率升高（P＜0.05）。具体见表。

表 ITP患者外周血T细胞亚群的分析 （%,±s）

表 ITP患者外周血T细胞亚群的分析 （%,±s）

aP＜0.05 ITP组vs对照组。

组别 n CD3 CD4 CD8 CD4+/CD8+ITP 组 30 69.74±9.01 29.00±9.23a 34.18±9.45a 1.06±0.41a对照组 30 73.63±7.01 40.05±5.40 28.12±4.38 1.54±0.43

2.2 ITP患者外周血Th17细胞的百分率

ITP患者组的Th17细胞的百分率：（2.71±1.02）%，对照组Th17细胞的百分率：（2.01±0.48）%。ITP患者组的Th17细胞的百分率较对照组升高（P＜0.05），差异具有统计学意义。见图1。

图1 Th17细胞的流式检测分析

以CD4+T IL-17+界定为Th17细胞，即右上象限为Th17细胞百分率。a为健康对照者，b为ITP患者。

3.讨论

ITP是一因血小板免疫性破坏，导致外周血中血小板减少的出血性疾病。其发病机制未完全明了，目前大量研究表明体液、细胞免疫异常均参与ITP的发病过程。T细胞主要分为CD4+和CD8+T细胞，CD4+/CD8+T细胞之间的平衡是维持机体免疫稳定的中心环节。冯建军等[5]研究发现ITP患者存在CD4+/CD8+T细胞比例失衡，提示T细胞亚群失调参与了ITP的发病过程。本实验再次证实与对照组相比ITP患者组CD4+T细胞百分率减低，CD8+T细胞百分率升高，CD4+/CD8+T细胞比率降低。ITP患者存在CD4+/CD8+T细胞比例失调，T细胞亚群失衡参与了ITP的发病过程。本实验测得ITP患者组CD3+T细胞百分率较对照组降低但无统计学差异，与冯建军等研究报道不一致，其可能的原因有待于进一步研究。

Th17细胞是2005年Park[2]在实验性自身免疫性脑脊髓炎和胶原蛋白诱导性关节炎典型的自身免疫性动物模型的研究中发现的不同于Th1、Th2细胞的CD4+T细胞亚群。Th17细胞是因特异性分泌IL-17而得名。IL-17具有促炎反应作用。研究表明Th17细胞参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等[3,6,7]自身免疫性疾病的发病过程。本实验测得ITP患者组Th17细胞百分率较对照组升高。提示ITP患者体内Th17细胞数量增多，分泌过多IL-17，通过IL-17参与ITP的发生、发展。因此Th17细胞百分率增高可能参与ITP的发病过程。

总之，本研究再次证实了ITP患者CD4+T细胞百分率降低，CD8+T细胞百分率升高，存在CD4+/CD8+T细胞比例失衡，细胞免疫异常参与ITP的发病过程。ITP患者Th17细胞百分率升高，通过对Th17细胞的深入研究有助于进一步明确ITP的发病机制，为临床治疗ITP提供新的靶点。