女士保健酒功效成分含量阿魏酸测定研究
2018-12-20梁慧珍张长霞贾士儒
李 妍，梁慧珍，张长霞，苏 静，陈 鹏，贾士儒
(1.天津科技大学生物工程学院，天津300457； 2.天士力控股集团研究院健保食品开发中心，天津300410）
女士保健酒是由当归、人参、黄精、玉竹、枸杞子、大枣6味药材渗漉而成的18%vol保健酒，具有美白祛斑、调经止痛、补血活血、益气安神之功效。其中当归中的阿魏酸（ferulic acid，FA），化学名为：4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸，是广泛存在于当归、川芎、红花等中药材的有效成分之一[1]，常作为中药成分及其制剂中定性定量的化学指标用于评价和控制制剂的质量[2]。药理研究表明，阿魏酸具有抗氧化、抑制血栓的形成、增加冠脉流量、改善心肌缺血、抑制胶原和ADP诱导的血小板聚集作用。目前阿魏酸已成为临床应用的活血祛淤药物之一[3]。当归中的阿魏酸在较低浓度下能显著降低酪氨酸酶的单酚酶活力，也是一种强效的酪氨酸酶抑制剂[4]。5 mol/L的阿魏酸都可有效地抑制虾血淋巴褐变，阿魏酸将虾血淋巴中酪氨酸酶酶活抑制至5.97%[5]。在实际应用中，发现阿魏酸水溶液放置一段时间后,在阿魏酸色谱峰旁出现一小峰[6-7]。后出现的峰很可能是阿魏酸的转化产物。而且随着时间的延长,转化产物的量越来越大,直至最后达到平衡。已有许多学者研究表明，阿魏酸的性质不稳定。贾晓斌等[8]研究表明，阿魏酸在溶液中不稳定，其样品溶液和对照品溶液均出现了不同程度的降解；康宇红等[9]考察了pH值及温度对阿魏酸钠注射液稳定性的影响，研究结果表明，其稳定性受pH值和温度影响较大；李行利等[10]的研究结果表明，阿魏酸的降解反应属于一级动力学反应，但是都没有对这些现象进行深入探讨和给出合理的解释。
稳定性研究是保健酒研究与开发的一项重要内容，是保证保健酒有效性和安全性的重要基础。功效性成分若发生分解、变质，不仅会影响其外观，而且可引起有效成分的含量变化和效果的降低，导致保健酒失效，甚至产生或增加毒副作用，危及患者的健康和生命安全。
稳定性试验的目的是考察女士保健酒在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为保健酒的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立保健酒的有效期。
加速试验是指在保证不改变产品失效机理的前提下,通过强化试验条件,使受试产品加速失效,以便在较短时间内获得必要信息,来评估产品在正常条件下的可靠性或寿命指标。通过加速试验,可迅速查明产品的失效原因,快速评定产品的可靠性指标。
为保证女士保健酒的质量，本研究采用高效液相色谱法检测保健酒中的阿魏酸，优化检测方法。并用加速试验考察3批女士保健酒中阿魏酸的稳定性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂（表1）
表1 实验所用试剂
枸杞子、玉竹和黄精，2017年购于国药乐仁堂河北药业有限公司；林下山参，2016年购于辽宁天士力森涛参茸股份有限公司；当归，2017年购于甘肃汉草品汇中药饮片有限公司；大枣，2017年购于沧州铭鑫食品有限公司；食用酒精，2017年购于吉林省新天龙实业股份有限公司。
经检验，枸杞子中的水分、总灰分、浸出物、枸杞多糖，玉竹中的水分、总灰分、浸出物、玉竹多糖，黄精中的水分、总灰分、浸出物、黄精多糖，林下山参中的水分、总灰分、人参Rg1、人参Re、人参Rb1，当归中的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、挥发油、阿魏酸，均符合《中国药典》（2015年版第1部）的规定。
1.2 仪器与设备
色谱柱（Venusil MPC_18(2)），天津博纳艾杰尔科技有限公司；KQ-250E型超声波清洗器（KQ250），昆山市超声仪器有限公司；安捷伦1260高效液相色谱仪（1260 InfinityII），美国安捷伦公司；Milli-Q超纯水处理系统（Milli-QAdvantage），北京艾泽信科技有限公司密理博北京代理；XS105型十万分之一天平（XS105 DualRange），梅特勒-托利多仪器上海有限公司；生化培养箱（SPX-250BIII），天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 阿魏酸检测
1.3.1.1 供试品溶液制备
取女士保健酒成品酒（批号：20170103）过0.45µm滤膜后备用。
1.3.1.2 对照品溶液制备
取阿魏酸对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加70%甲醇制成12µg/mL的溶液，即得。
1.3.1.3 色谱条件[11]
色谱柱：Venusil MPC18(2)（4.60×250 mm，5µm），流动相：乙腈-0.085%磷酸溶液（17∶83）；检测波长为316 nm；柱温35℃，流速0.80 mL/min，进样量：10µL。
1.3.1.4 线形关系考察
分别精密吸取已配制好的浓度为0.036 mg/mL的对照品阿魏酸溶液0.10 mL、0.70 mL、1.40 mL、2.10 mL、2.80 mL、3.50 mL于5 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样10µL，记录色谱图和峰面积。以峰面积Y为纵坐标，阿魏酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.1.5 精密度实验
取同一批次女士保健酒，按照“1.3.1.1”制备供试品溶液1份，按照“1.3.1.3”方法，连续进样6次，记录阿魏酸峰面积。
1.3.1.6 稳定性实验
精密取吸女士保健酒样品按照“1.3.1.1”制备供试品溶液和“1.3.1.2”的阿魏酸对照品溶液，按照“1.3.1.3”方法，分别于配制后的0、1.5 h、3 h、4.5 h、6 h、7.5 h进行测定，记录阿魏酸峰面积。
1.3.1.7 重复性实验
取同一批次女士保健酒，按照“1.3.1.1”制备供试品溶液6份，按照“1.3.1.3”方法测定并计算。
1.3.1.8 专属性实验
阿魏酸专属性样品制备：女士保健酒的处方中不加入当归药材制成的渗漉液为阴性对照。将阴性对照、按照“1.3.1.1”制备的女士保健酒供试品溶液及阿魏酸标准溶液按照“1.3.1.3”方法色谱条件进行检测。记录液相色谱图。
1.3.1.9 加样回收率实验
取“1.3.1.5”同一女士保健酒样品按照“1.3.1.1”制备供试品溶液5 mL 9份，置于10 mL容量瓶中，以“1.3.1.5”测得的阿魏酸平均含量值作为加入对照品含量的依据，约供试品中阿魏酸含量55.13%、110.25%、175.01%的对照品各3份分别对应加供试品溶液，共9份，摇匀，按“1.3.1.3”方法测定，计算阿魏酸的含量和回收率。
1.3.2 阿魏酸的稳定性
根据《中国药典》2015年版第2部附录药物制剂稳定性试验指导原则的有关要求,对女士保健酒中阿魏酸的稳定性进行试验研究。取一定数量按1.3.1.5方法测定同一女士保健酒样品,置于37℃的恒温培养箱(温差±1℃)内3个月。每7天定时取样,每次2支,混匀,依法测定含量。
2 结果与分析
2.1 阿魏酸检测
2.1.1 线性关系考察
按照“1.3.1.4”方法操作，以峰面积Y为纵坐标，阿魏酸浓度为横坐标，得线性回归方程为Y=63989X-0.7676，R2=0.9999，结果表明，阿魏酸进样量在0.0072～0.25µg范围内具有良好的线性关系（见图1）。
图1 阿魏酸标准曲线
2.1.2 精密度
按照“1.3.1.5”操作，计算结果的6次进样峰面积RSD为1.02%，见表2。表明仪器精密度良好。
表2 精密度考察结果
2.1.3 稳定性
按照“1.3.1.6”方法操作，发现女士保健酒中的阿魏酸在7.5 h内稳定，计算结果的阿魏酸峰面积RSD为1.49%，见表3。表明供试品溶液在7.5 h内的稳定性良好。
表3 稳定性考察结果
2.1.4 重复性
按照“1.3.1.7”方法操作，计算结果阿魏酸平均含量为0.006887 mg/mL，RSD为1.02%，见表4，表明本法重复性良好。
表4 重复性考察结果
2.1.5 专属性
按照“1.3.1.8”方法操作，在阴性对照色谱图中，阿魏酸保留时间处未检测到色谱峰，表明方法专属性良好，见图2、图3、图4。
图2 阿魏酸标准品HPLC图
2.1.6 加标回收率
按照“1.3.1.9”方法操作，计算结果见表5，平均回收率为102.38%，RSD为1.41%。说明该方法满足分析测定的要求。
图3 女士保健酒供试品HPLC图
图4 阿魏酸专属性HPLC图
2.1.7 方法验证
取3批女士保健酒样品按“1.3.1.1”方法制备供试品溶液，并在“1.3.1.3”色谱条件下测定供试品溶液，每份样品进样2次，以平均峰面积计算阿魏酸含量，见表6。
表5 加标回收率实验结果
表6 保健酒中阿魏酸含量测定
2.2 阿魏酸的稳定性（图5）
由图5可知，阿魏酸浓度在28 d内缓慢下降，在28 d后急剧下降，在42 d后下降速率降低，直至56 d以后降至为零。由于女士保健酒中的阿魏酸在加速试验的3个月内不稳定，所以女士保健酒中的阿魏酸作为功效性指标不能支持24个月的有效期。
图5 阿魏酸稳定性
3 讨论
3.1 保健酒
保健酒稳定性研究在保健酒质量控制中是十分重要的，特别是含有不稳定成分的保健酒容易受各种环境条件如温度、光照和存放环境等因素影响发生降解或转化，随着时间的延长导致其质量发生变化、功效性指标效价降低。在保健酒有效成分中，不乏稳定性较差的指标成分，对这一类成分的分析对于保证和评价保健酒质量具有十分重要的意义。
3.2 高效液相色谱法的建立
本研究建立了高效液相色谱法(HPLC)测定阿魏酸及其降解产物的分析方法用于测定阿魏酸的含量，方法简单、快速、准确、灵敏度高。因此，本实验以这一方法来测定阿魏酸，为表征含有阿魏酸这一成分的保健酒提供手段，为更进一步地研究阿魏酸的降解规律提供必要的数据支持。
根据女士保健酒多数药材所含阿魏酸含量的特殊性，将检测试验适度优化。在药典中指出检测当归中阿魏酸的方法，但是没有提到流动相的流速和液相时长。经多次试验发现，检测女士保健酒中的阿魏酸采用0.8 mL/min的流速，使色谱中待测峰保留时间适中，峰形对称，且与杂质峰有较好的分离。在色谱图中显示，阿魏酸在22.5 min左右出峰并在30 min后没有杂峰出现，所以检测时间选择30 min。
3.3 方法验证
根据阿魏酸药理作用，选择其作为一款具有美白祛斑、抗衰老类型的保健酒的指标性成分，充分证明保健酒的抗衰老和抑制黑色素生长的功效。本实验经过色谱条件优化建立了检测保健酒中阿魏酸的HPLC检测方法，并对3批保健酒酒样进行了检测，经方法学验证该方法专属性、精密度、重复性、加标回收率、稳定性等均符合要求，可作为保健酒中阿魏酸成分含量快速准确的检测方法。
3.4 阿魏酸稳定性的考察
保健酒研究中稳定性试验结果以常温稳定试验的结果为准。但是在常温下考核试验耗时较长，不能及时掌握保健酒中功效性成分质量变化的速度和规律，也不易及时发现和纠正影响保健酒中功效性成分质量稳定性的条件和因素。本研究采用的恒温恒湿加速试验法研究女士保健酒中阿魏酸的贮藏稳定性，在较短时间内预测了女士保健酒中阿魏酸在常温条件下的质量稳定性，大大缩短了实验时间。
本研究以阿魏酸为代表对女士保健酒稳定性进行深入的研究，目前已有研究和文献报道了阿魏酸不稳定，然而在现有的质量控制条件下常常作为保健品的主要有效成分或指标成分之一，是因为它具有抗氧化、清除自由基、抑制血小板聚集和血栓形成等作用。通过研究明确了阿魏酸是否能作为女士保健酒的功效性指标。由于在加速试验中，28 d后阿魏酸含量急剧下降，56 d后阿魏酸含量过低，因此说明女士保健酒中的阿魏酸含量在常温下不能维持2年的稳定状态。
