共价有机聚合物固相萃取/高效液相色谱法测定面粉中3种荧光增白剂

丁 惠，纪文华，贺吉香*

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014)

荧光增白剂(FWAs)是一种具有复杂化学结构的荧光染料，由于其在吸收不可见紫外光(290～400nm)的同时可以发射比入射光范围更广的可见光(400～480nm)，所以能够提高基质的白度和亮度[1]。当前，FWAs被广泛应用于造纸、洗涤剂、塑料、纺织纤维等产品中，以达到增白增艳的效果[2]。为追求经济利益，一些不法商家将FWAs添加到食品及其包装材料中以提高产品的外观，吸引消费者。FWAs在人体内会与人血清蛋白结合，进入血液循环系统，而FWAs特殊的稳定结构导致其难以通过新陈代谢正常排出体外，从而在体内蓄积危及人类健康[3]。此外，FWAs会阻碍伤口愈合，且一旦在体内蓄积过量，将成为潜在的致癌因素[4]。国家标准GB/T27741-2011和GB31604.47-2016中规定了纸制品和食品接触材料中相关FWAs的检测方法及检出限，卫生部《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)》明确指出面粉中的荧光增白剂为违法添加的非食用物质。因此迫切需要建立一种高效便捷的食品中FWAs的检测方法。目前，FWAs的检测方法主要有荧光分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、高效液相色谱法(HPLC)[7]以及液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[8-9]。鉴于样品基质复杂，成分多样，且基质中FWAs的添加水平较低，因此选择合适的前处理方法实现对目标分析物的有效富集十分重要。

固相萃取(SPE)作为目前广泛应用的一种样品前处理方法，在食品检测[10]、环境监测[11]、生物样品分析[12]等领域发挥着重要作用。SPE能有效避免大量有机溶剂的使用，同时具有基质效应小、操作方便等优点，可在短时间内实现对目标分子的快速富集[13-15]。除了传统的C18、硅胶、氧化铝和氨基等固相萃取填料外，金属有机框架材料、氧化石墨烯、碳纳米管等新兴材料由于具有良好的吸附性能和较高的稳定性而得到广泛关注[16-19]。本文选择三氯化铋作为催化剂，使2,4,6-三羟基-1,3,5-苯三甲醛和2,6-二氨基吡啶在低温下聚合成一种具有良好吸附性能的共价有机多孔聚合物(COPs)。将COPs成功应用于固相萃取填料，基于此建立了荧光增白剂的高效液相色谱检测方法，该方法具有较好的检测灵敏度和准确性，能够用于实际样品的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet仪器公司);JW-BK132F型比表面积测定仪(北京精微高博科学技术有限公司);固相萃取装置(美国Supelco公司);Waters e2695高效液相色谱仪，配2998二极管阵列检测器及Empower3色谱工作站(美国Waters公司);超纯水由Milli-Q系统制得(美国Millipore公司)。

图1 3种荧光增白剂的化学结构式Fig.1 Molecular structures of three FWAs

1.2 COPs的制备

在50mL圆底烧瓶中加入0.63g TFP和0.22g2,6-DAP，加入14mL1,3,5-三甲基苯和二氧六环(6∶1，体积比)的混合溶剂，再加入0.013g BiCl3，超声10min后密封，置于室温下聚合反应8h。离心除去上清液，所得反应产物用滤纸包裹置于索氏提取器中，以甲醇-三氟乙酸(9∶1，体积比)回流24h除去未反应的原料，再用甲醇洗至中性，真空干燥24h。研磨后得到褐色产物，避光保存。

1.3 等温吸附实验

称取10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL系列质量浓度的3种FWAs标准溶液(1～60mg·L-1)，室温振荡120min后，离心去除聚合物，上清液过0.45μm滤膜并采用HPLC测定。聚合物的平衡吸附量(Qe,mg·g-1)由下式计算得到：Qe=(Ci-Ce)V/m，其中，Ci(g·L-1)和Ce(g·L-1)分别为FWAs的初始质量浓度和吸附达平衡时的质量浓度；V(mL)为标准溶液体积；m(mg)为聚合物的质量。

1.4 吸附动力学实验

将10mg COPs加至10mL螺口玻璃瓶中，然后加入2.5mL50mg·L-1的FWAs标准溶液，室温下振荡3～80min，离心后取上清液，过0.45μm滤膜并采用HPLC测定，以考察聚合物对目标分析物的传质速率。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：Symmetry®C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：370nm；流速：1.0mL·min-1；流动相：A为甲醇，B为0.1%三氟乙酸水溶液，梯度洗脱程序：0～4min，94% A；4～5min，94%～91% A；5～16min，91%A。

1.6 实际样品的制备

实验用面粉均购自济南当地超市、市场和粮油店。精密称取1.0000g样品于100mL锥形瓶中，以50mL 氯仿超声提取30min，离心后，取上清液用氯仿定容至50mL，待测。

2 结果与讨论

2.1 COPs的制备

相较于传统的高温聚合方法，本实验借鉴Matsumoto等[20]的研究，采用低温聚合的方法使单体快速聚合。考察了原料的不同配比对聚合物吸附容量(Qe)的影响。结果显示，当TFP和2,6-DAP的摩尔比为3∶2时，Qe达最大值(0.28mg·g-1)，随着原料中2,6-DAP的增多，Qe有所下降。同时评价了另外3种催化剂(Sc(OTf)3、InCl3.4H2O、TsOH)所制聚合物的吸附能力，得到其Qe分别为0.11、0.14、0.06mg·g-1，均低于BiCl3催化下形成的COPs对目标分析物的吸附容量(0.28mg·g-1)，因此实验最终选择BiCl3作为合成COPs的催化剂。

2.2 COPs的性能表征

2.2.1比表面积根据BET氮气吸附等温线评价COPs的物理特性，测得COPs的比表面积为271 m2·g-1，相应的孔穴体积为0.120 m3·g-1，表明COPs具有多孔性，从而具有较大的吸附容量。根据IUPAC分类，COPs的N2吸附等温线的形状可归属于Ⅳ型等温线，推断聚合物为介孔类吸附剂材料。

图2 COPs的红外光谱Fig.2 FT-IR spectra of COPs

2.3 等温吸附实验

利用等温吸附实验测定COPs对FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附量(图3A)，结果显示，COPs的吸附量随着FWAs质量浓度的增大而增加。当FWA 368、FWA 367和FWA 393的初始质量浓度分别超过40、30、30 mg·L-1时，COPs对目标化合物的平衡吸附量不再变化，此时达到饱和吸附容量。

选择Freundlich和Langmuir吸附模型评估COPs对3种FWAs的吸附性能，结果见表1，KF和KL分别为两方程的平衡常数，n为吸附强度，Qm为理论最大吸附量。根据计算结果可知，Freundlich吸附模型与数据的拟合关系更好(r2≥0.921)；n>1，表明COPs对FWAs的吸附存在多种不同的结合位点，具有良好的吸附性能。

表1 COPs吸附FWAs的Freundlich和Langmuir吸附模型Table 1 Freundlich adsorption models and Langmuir isotherm models for FWAs onto COPs

*ydenotes lgQe，xdenotes lgCe;**ydenotesCe/Qe,xdenotesQe

2.4 吸附动力学实验

计算不同时间内聚合物对50 mg·L-1FWA 367、FWA 368和FWA 393的吸附容量，可得到COPs对FWAs的动态吸附曲线(图3B)，COPs对3种FWAs具有较高的传质速率，FWA 367、FWA 368和FWA 393分别在30、40、35 min达到最大吸附量。

吸附动力学数据分别用Lagergren准一级动力学模型和准二级动力学模型进行拟合分析(表2)，其中k1和k2分别为两方程的吸附速率常数，Qe分别由实验和拟合方程得出。由表2可知，准一级动力学模型的拟合相关系数(r2≥0.868)相对较高，且由准一级动力学模型得到的平衡吸附量与实验值更为接近，故准一级动力学模型更适用于本实验的动力学数据分析。

表2 COPs吸附FWAs的准一级动力学模型和准二级动力学模型Table 2 Pseudo-first order kinetic model and pseudo-second order kinetic model for FWAs onto COPs

2.5 固相萃取(SPE)条件的优化

通过3种荧光增白剂在氯仿、乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃、甲醇、乙腈等不同有机溶剂中的溶解性实验发现，氯仿可以较好地溶解FWA 367、FWA 368和FWA 393，因此选用氯仿作为样品萃取溶剂及SPE上样溶剂。

2.5.1吸附剂的用量将40～150 mg聚合物分别装填到1 mL的固相萃取小柱中，考察不同吸附剂用量对3种荧光增白剂的吸附效果。结果显示，当吸附剂用量为100 mg时，FWA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分别为97.2%、98.4%和94.1%。当吸附剂用量小于100 mg时，回收率降至90%以下；而当吸附剂用量高于100 mg时，上样流速降低，分析时间延长。因此实验确定吸附剂的最佳用量为100 mg。

2.5.2流速的优化实验表明，当上样流速为1～5 mL·min-1时，3种荧光增白剂的回收率均大于90%；当流速增至6 mL·min-1时，FWA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分别降至72.3%、81.5%和76.7%。综合考虑分析时间和回收率，最终确定流速为5 mL·min-1。

2.5.3洗脱剂的优化分别选用甲醇-三氟乙酸(9∶1)、氯仿-甲醇-三氟乙酸(6∶3∶1)和氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作为洗脱剂，考察了不同体积比的洗脱剂对FWAs的洗脱能力，同时考察了不同体积(1～9 mL)的洗脱剂对目标化合物回收率的影响。结果表明，以5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)为洗脱剂时，FWA 367、FWA 368和FWA 393的回收率分别为98.2%、101%和98.7%，因此实验选用5 mL的氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)作为洗脱剂。

2.6 方法学验证

将3种FWAs标准溶液逐步稀释，得到质量浓度分别为1、10、20、30、40、60、70、80、90、100 μg·L-1的标准溶液。在最优固相萃取条件下，洗脱液经HPLC依次测定，3种FWAs在1～100 μg·L-1范围内具有良好的线性关系(r2≥0.996 2)。以3倍信噪比(S/N=3)时的质量浓度作为方法的检出限(LOD)，S/N=10时的质量浓度为定量下限(LOQ)，得到3种FWAs的LOD为0.15～0.27 μg·kg-1，LOQ为0.50～0.89 μg·kg-1(见表3)，表明该方法具有较高的检测灵敏度。

表3 3种FWAs的线性关系、检出限、定量下限、加标回收率及相对标准偏差Table 3 Linear relationships,detection limits,quantitation limits，recoveries and RSDs of three FWAs

对阴性面粉基质进行3种不同水平(10、30、60 μg·kg-1)FWAs标准溶液的加标回收实验(n=6)，由表3可知，样品经SPE富集后，3种FWAs的回收率为81.2%～102%，相对标准偏差(RSDs)为4.3%～12.7%。

相比于其他文献方法(表4)，本方法具有较低的检出限和定量下限，同时样品前处理方法简单，有机溶剂用量少，具有相对较高的回收率，结果准确，能够实现面粉中荧光增白剂的定性定量检测。

表4 样品中荧光增白剂的检测方法比较Table 4 Comparison of the proposed method with other methods for the determination of FWAs in samples

2.7 与商用SPE填料的比较

对比了C18、硅胶(Silica)、硅酸镁(Florisil)和中性氧化铝(Alumina N)为吸附填料的商用SPE柱和COPs固相萃取对3种FWAs的吸附能力。图4A为上述5种SPE填料在首次使用时对3种FWAs的回收率，其中COPs对FWAs的回收率高达98.8%，明显优于其他吸附材料。同时，以3种FWAs的平均回收率为响应值，对比了上述SPE柱经吸附-解吸附循环使用后的吸附能力(图4B)。结果显示，以COPs为填料的SPE柱经12次循环使用后，回收率仍高达87.8%，而其他几种填料的回收率已降至60%以下，无法满足分析检测的要求。

2.8 实际样品的应用

将COPs作为吸附剂，以优化后的SPE条件对面粉中的FWAs进行富集，取100 mg的COPs装填到SPE小柱中，经3 mL甲醇和2 mL氯仿活化后，将样品溶液以5 mL·min-1通过SPE小柱，然后用5 mL氯仿-甲醇-三氟乙酸(7∶2∶1)洗脱，洗脱速度为1 mL·min-1，洗脱液用氯仿定容至5 mL后按本方法进行检测。从超市、市场和粮油店随机购买10批面粉，经上述最优条件处理后进行检测，在2份面粉样品中检出FWA 393，含量分别为14.2、11.3 μg·kg-1，表明样品包装材料中的荧光增白剂发生迁移或不法商家违法添加了荧光增白剂。

3 结 论

本文以TFP和2,6-DAP为单体，BiCl3为催化剂，采用低温聚合法成功制得具有良好吸附性能的共价有机多孔聚合物。通过BET等温吸附实验，发现该聚合物具有较大的比表面积和孔穴体积，能够用于SPE填料。以COPs吸附剂为填料，建立了荧光增白剂的SPE/HPLC分析技术，方法操作简单，重现性好，可实现荧光增白剂的快速富集，并成功应用于面粉中3种荧光增白剂的高灵敏检测。