反相/亲水/阳离子交换混合模式色谱固定相的制备及在药物分离中的应用

王晓欢

(天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072)

随着新药的不断开发，药物分子呈现多样的化学结构和性质。据统计，48.6%的生物活性药物保持中性形式，51.4%的药物以盐的形式存在，其中包括38.6%的碱性药物和12.8%的酸性药物[1]。因此对复杂类型的药物进行有效分离非常重要。高效液相色谱作为一种分离手段在药物分析领域具有广泛应用。反相色谱(RPLC)以其广泛的选择性和灵敏度，成为最常用的色谱模式，但对极性和离子型化合物保留很弱，在高水相条件下不易润湿，且残留硅醇基将导致碱性化合物的峰形拖尾[2]。离子交换色谱(IEC)通过静电相互作用，实现了离子型化合物的分离，但对中性化合物无保留。离子对色谱(IPC)通过引入离子对试剂，提高了对离子型化合物的保留和选择性，能够同时分离中性和离子型的化合物[3]，但平衡时间长，离子对试剂不易洗脱，且大多数离子对试剂与质谱不兼容。

混合模式色谱(MMC)的发展解决了单一模式色谱分离容量受限的难题，通过固定相表面不同功能基团与溶质的多种相互作用，可用于不同色谱模式分离或不同类型化合物的同时分离[4-5]。目前，该领域引起了许多研究者的兴趣，多种保留机制结合的混合模式色谱被开发。Wei等[6]通过极性嵌入方法将C18和季铵基团相结合制备了一种反相/阴离子交换(RP/SAX)混合模式固定相，可在反相模式下分离甲苯和乙苯，离子交换模式下分离酸性化合物，并且该固定相能与全水相兼容。Zimmermann等[7]通过N-(10-十一酰)-3-氨基奎宁环改性二氧化硅基质，合成了一种反相/弱阴离子交换(RP/WAX)混合模式固定相，相比于IPC和WAX在分离寡核苷酸方面具有更强的选择性。Li等[8]通过在多孔硅球表面多次涂覆聚合物的方法，开发了一种反相/阴离子交换/亲水(RP/SAX/HILIC)三模式固定相，可在HILIC模式下分离极性小分子，RP/SAX混合模式下同时分离中性和离子型化合物。

强阳离子交换色谱作为混合模式色谱中最重要的保留模式之一，能够提供独特的保留机制和选择性，已广泛用于金属离子[9]、碱性药物[10]和生物分子的分离[11-12]。传统磺酸基阳离子固定相常通过在硅胶表面键合苯基的基础上，用氯磺酸酸化制得。然而，强酸条件易导致键合相丢失，同时磺化反应剧烈，导致磺酸基表面覆盖率不可控，且对环境不利。而点击化学反应是在温和条件下，通过不同小单元的拼接，快速精准的合成各种目标分子，该方法主要包括叠氮-炔基Husigen环加成反应、Diels-Alder反应和巯基-烯点击化学反应3类，具有简单、高效和高选择性的特点，在分离材料制备中得到越来越多的应用。而无金属离子参与的巯基-烯点击化学反应的条件温和、环保、选择性好、产率高，为色谱固定相表面功能化修饰提供了重要途径[13-15]。

本文通过巯基-烯点击化学方法，在硅胶表面键合巯基的基础上，对其进行苯磺酸和苯基的表面改性，制备RP/HILIC/SCX混合模式色谱固定相。采用元素分析和13C固体核磁共振(13C NMR)对该固定相进行表征，利用多种色谱评价体系对其反相、亲水和离子交换色谱行为进行评价，并将其应用于二甲双胍及其杂质的检测，以及酸性、中性和碱性药物的同时分离。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian InfinityPlus-300MHz固体核磁共振谱仪(美国Palo Alto公司)；Vario Micro Cube元素分析仪(德国Elementar公司)；安捷伦1100高效液相色谱分析仪(美国安捷伦公司)；球形硅胶(9.8μm，292m2/g，10nm)、Haskel AW-60高压匀浆装柱系统(天津市倍思乐色谱技术开发中心)。

巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS，湖北武大有机硅新材料股份有限公司)；对苯乙烯磺酸钠(上海源叶生物科技有限公司)；苯乙烯、三乙胺(TEA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯、1-萘胺、对苯二胺、三聚氰胺(天津市光复精细化工研究所)；甲苯、对硝基苯胺、对氯苯胺、苯胺(天津市江天化工技术有限公司)；双氰胺、盐酸二甲双胍、尿嘧啶、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶(上海麦克林生化科技有限公司)；对乙酰氨基酚、布洛芬、替硝唑、吲哚美辛、硫酸沙丁胺醇、盐酸普鲁卡因胺、盐酸可乐定标准品(中国药品生物制品检定所)。

1.2 Ph/BS固定相的制备

称取4g活化的SiO2微球于反应釜中，加入1.8mL(9.6mmol) MPTMS和1.0mL(7.2mmol)TEA，于150℃马弗炉中反应8h，冷却后分别用甲醇、乙醇-水(1∶1，体积比)、甲醇洗涤,80℃下减压干燥过夜，得到巯丙基硅胶(MPS)。

将4g MPS微球和80mL甲醇分散于150mL反应瓶中，然后加入0.04g(0.24mmol)AIBN、0.165g(0.8mmol)对苯乙烯磺酸钠(SS)和184μL(1.6mmol)苯乙烯(St)，连续振荡溶解后通氮气除氧，用四氟带密封，置于70℃恒温水浴摇床中振摇12h，依次用甲醇、乙醇-水(1∶1)、甲醇洗涤后,80℃下减压干燥过夜，得到苯基-苯磺酸基双配体混合模式固定相(Phenyl/Benzenesulfonate phase,Ph/BS)。与上述合成途径相同，反应过程不加St，得到苯磺酸修饰的单配体固定相(Benzenesulfonate phase,BS)作对照。将Ph/BS填料和BS填料装入不锈钢柱管(150mm×4.6mm i.d.) 得到色谱分析柱。

1.3 色谱评价

反相评价体系：分离苯同系物：流动相为甲醇-水(60∶40,体积比)，检测波长为254nm。

亲水评价体系和两亲性保留机理研究：分离核苷及碱基类化合物，流动相为乙腈-20mmol/L乙酸铵，检测波长为254nm。

离子交换评价体系：分离含氮碱性化合物，流动相为乙腈-60mmol/L KH2PO4(pH3.0)(50∶50,体积比)，检测波长为240nm。以上体系的流速均为1.0mL/min，柱温25℃。

1.4 应 用

分离双氰胺、三聚氰胺和二甲双胍：流动相为1.7%NH4H2PO4(pH3.0)，检测波长为218nm，流速为1.0mL/min，柱温为40℃。

分离酸性、中性和碱性药物:流动相为乙腈-60mmol/L KH2PO4(pH3.0)(35∶65,体积比)，检测波长为220nm，流速为1.5mL/min，柱温为30℃。

图1 Ph/BS固定相的固体核磁碳谱Fig.1 13C CP MAS NMR spectrum of Ph/BS stationary phase

2 结果与讨论

2.1 表 征

Ph/BS固定相的表面结构通过13C NMR表征，并对碳原子进行归属(图1)。烷基链上的碳原子和甲氧基碳原子的信号在10～51ppm，苯环上的碳原子信号在126～144ppm，其中与磺酸基相连的碳原子在高化学位移处出峰。结果表明苯磺酸和苯基已在固定相表面成功键合。

通过元素分析对固定相进行定量表征。巯丙基键合硅胶(MPS)的元素含量分别为：C3.88%,S2.42%，根据式(1)计算得到巯丙基键合量为4.23μmol/m2。

(1)

其中，SBET为固定相的比表面积，36和118分别表示增加1个MPS分子所增加的碳元素质量和总质量。Ph/BS固定相的元素含量为：C7.86%,S2.86%,对苯乙烯磺酸钠(SS)和苯乙烯(St)的键合量测定公式如下：

(2)

(3)

计算得到Ph/BS固定相上苯磺酸和苯基的键合量分别为0.48、0.98μmol/m2,BS固定相上苯磺酸的键合量为0.55μmol/m2。两种固定相表面的苯磺酸键合量基本相同，差别仅在于苯基键合量不同。因此，巯基-烯点击化学方法制备双配体混合模式固定相，保证了合适的磺酸基键合量，并且能够灵活调控苯基的键合量从而进一步提高固定相的碳载量。

2.2 色谱评价

2.2.1反相评价采用一系列烷基苯同系物评价了Ph/BS固定相的疏水性和亚甲基选择性，在相同的色谱条件下，烷基苯同系物在BS和Ph/BS两个固定相上均得到较好的保留和分离(图2)，但在双配体Ph/BS固定相上的保留和分离度明显增加，原因是疏水性苯基增加了固定相的反相作用和π-π相互作用。考察了流动相中水含量(35%、40%、45%、50%)对Ph/BS固定相上烷基苯同系物保留因子的影响，结果显示溶质的保留随流动相中水相比例的增加而显著增加，进一步证明了Ph/BS固定相的反相色谱行为。以保留因子的对数与烷基苯侧链上的亚甲基数目作图，两者在不同流动相条件下均呈现较好的线性关系(见图3)，说明Ph/BS固定相具有较好的亚甲基选择性。

图3 Ph/BS固定相上烷基苯同系物lgK与亚甲基数目的关系图Fig.3 Plot of lgK vs number of methylene groups on Ph/BS phase mobile phase:() methanol-water(60∶40); () methanol-water(55∶45);() methanol-water(50∶50)

2.2.2亲水评价极性磺酸基的存在使得Ph/BS固定相可用于亲水色谱模式[16]。核酸类小分子化合物常用于评价亲水固定相的色谱性能，因此考察了流动相中不同乙腈-20 mmol/L乙酸铵体积比(90∶10、94∶6、95∶5)时5种核苷和碱基在BS和Ph/BS两种固定相上的色谱行为(图4)。由图可知，在上述3种流动相条件下，5种物质在两个固定相上均得到较好分离，且出峰次序一致，为尿嘧啶<尿苷<腺苷<腺嘌呤<胞嘧啶。随着流动相中乙腈含量的增加，溶质的保留和分离度相应增加，且极性越大的化合物变化越明显，体现了亲水色谱的保留特征。在相同的色谱条件下，极性溶质在两个固定相上的亲水保留行为差别不大，原因是其表面的磺酸基键合量基本一致，故与溶质间的极性相互作用也基本相同。

2.2.3两亲性保留机理上述结果表明，由于Ph/BS固定相表面含有亲水基团(—SO3H)和疏水基团(—Ph，—CH2)，因此具有亲水和反相双重保留特性。实验以尿嘧啶、尿苷、腺苷、腺嘌呤、胞嘧啶5种核苷和碱基作为测试样品，在5%～95%范围内改变流动相的水相含量，考察溶质分子的保留因子与流动相中水相含量的关系。结果表明在低水相条件下(<50%)，溶质的保留因子随水相含量的增加而减小，说明亲水保留行为占主导。而在高水相条件下(>50%)，溶质的保留因子随流动相中水相含量的增加而增大，体现了反相保留特性。综上，溶质在该固定相上的保留随流动相中水相含量的改变呈现U型曲线特征，说明Ph/BS固定相具有RP/HILIC双重保留机理[17-18]。

2.2.4离子交换评价在酸性条件下，对硝基苯胺、对氯苯胺、1-萘胺、苯胺、三聚氰胺和邻苯二胺6种胺类小分子化合物解离带正电荷，可用于评价Ph/BS固定相的离子交换行为。在乙腈-60 mmol/L KH2PO4(pH 3.0)(50∶50)流动相条件下，6种化合物得到较好的保留和分离(图5)。由图5知，6种胺类小分子的保留顺序与其pKa有关，且pKa越大(即碱性越强)，保留时间越长，符合离子交换的保留特征。除了对硝基苯胺的保留较弱外，其他5种胺类化合物的保留因子随着流动相中钾离子浓度的增加而减小，进一步证明了离子交换保留机理。将5种溶质的保留因子对数与流动相中钾离子浓度对数作图，得到斜率依次为-0.52、-0.50、-0.78、-1.04、-1.13。由于对氯苯胺、1-萘胺和苯胺的lgP较大，除离子交换作用外，与固定相间还存在反相作用[19]，因此其斜率小于理论值-1。而三聚氰胺和邻苯二胺的反相作用很弱，几乎只有离子相互作用，因此斜率接近于理论值-1。

图4 BS固定相(A) 和 Ph/BS固定相(B)对核苷类化合物的分离Fig.4 Separation of nucleoside compounds on BS phase(A) and Ph/BS phase(B)1.uracil，2.uridine，3.adenosine，4.adenine，5.cytosine;volume ratio of acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate：a.90∶10,b.94∶6,c.95∶5

图5 Ph/BS固定相分离胺类化合物的色谱图Fig.5 Chromatogram of amine solutes separation on Ph/BS phase1.p-nitroaniline;2.p-chloroaniline;3.1-naphthylamine;4.aniline;5.melamine;6.p-phenylene diamine

2.3 应 用

2.3.1二甲双胍及其杂质的分离二甲双胍是一种降血糖药物，常用于Ⅱ型糖尿病的治疗。双氰胺和三聚氰胺作为其反应中间体，具有一定毒性，必须进行严格控制以确保用药安全有效。在“1.4”条件下，Ph/BS固定相能够很好地分离二甲双胍和原料杂质双氰胺(图6)，且三聚氰胺与二甲双胍的分离度为11.4，满足药典规定的分离度大于10.0的要求。另外，三聚氰胺和二甲双胍的峰形对称，理论塔板数分别为30 013和24 080，相比于药典分析方法(15 000/m)的柱效更高，因此，Ph/BS固定相可在SCX模式下用于二甲双胍制剂的质量检测和控制。

2.3.2酸性、中性与碱性药物的同时分离由于Ph/BS固定相具有RP/SCX性质，可用于中性和离子型药物的同时分离。在“1.4”条件下，中性(对乙酰氨基酚、替硝唑)、酸性(布洛芬：pKa 5.2；吲哚美辛：pKa 4.5)和碱性药物(沙丁胺醇：pKa 9.3；普鲁卡因胺：pKa 9.2；可乐定：pKa 8.05)在Ph/BS固定相上均得到较好的分离(图7)。在pH 3.0条件下，布洛芬和吲哚美辛不解离，因此与磺酸基所带负电荷不存在离子排斥作用，从而在固定相上保留。中性和酸性药物在Ph/BS固定相上的保留依靠疏水相互作用，lgP越大，保留越强，洗脱次序为对乙酰氨基酚(lgP1.42)<替硝唑(lgP2.14)<布洛芬(lgP3.07)<吲哚美辛(lgP3.93)。碱性药物在pH 3.0条件下带正电荷，除疏水作用外还存在离子交换作用，因此比酸性和中性药物的保留更强。

图6 Ph/BS固定相分离双氰胺、三聚氰胺和二甲双胍的色谱图Fig.6 Chromatogram of dicyandiamine,melamine and melbine separated on Ph/BS phase1.dicyandiamine;2.melamine;3.melbine

图7 Ph/BS固定相同时分离酸性、中性和碱性药物的色谱图Fig.7 Chromatogram of acidic,neutral and basic drugs separated on Ph/BS phase1.acetaminophen;2.tinidazole;3.ibuprofen;4.indomethacin;5.salbutamol;6.procainamide;7.clonidine

3 结 论

本文制备并表征了双配体苯磺酸混合模式固定相。采用多种测试体系对Ph/BS固定相进行色谱性能评价，发现其分离过程涉及疏水作用、π-π作用、极性作用和阳离子交换等多种作用形式，对核苷类小分子的保留体现了RP/HILIC双重保留机理。相比于单配体BS固定相，在保证相同极性的条件下，Ph/BS固定相可添加疏水苯基来增加反相保留行为，说明该方法可灵活调节各功能配体的比例，以满足不同的分离要求。该混合模式固定相在SCX模式下用于二甲双胍及其杂质的高效分离分析，效果优于药典方法；在RP/SCX 混合模式下可实现酸性、中性和碱性药物的同时分离。研究结果表明，所制备的固定相在复杂体系的分离分析方面具有潜在的应用价值。