基于智能手机定量测定蛋白质的方法研究

戴 斌，彭 琳，罗继全，李宗祥，王 玲,焦荣华，杨赛男*

(1.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421000；2.湖南省医疗器械检验检测所，湖南 长沙 410000；3.三诺生物传感股份有限公司，湖南 长沙 410000)

比色法是一种常用的定量检测方法，其原理是通过分光光度计等设备测定光吸收率，再根据朗伯比尔定律进行浓度换算，但其检测设备笨重，不适合检测物的实时现场检测。近年来，基于图像比色的方法得到发展，该法可直接利用图像进行定量，已有研究利用扫描仪[1-3]、数码相机[4-6]、CCD摄像头[7-9]、智能手机[10-12]等进行物质浓度的检测，分析对象包括金属离子[13-14]、葡萄糖[15-16]、亚硝酸盐[17]、甲醛[18]、链霉素[19]等。其中，智能手机由于集成了前后摄像头、多核处理器等模块，具有强大的图像采集和分析处理能力，且便携性高，大大提高了检测系统的便携性与操作性。

图像比色法先利用设备获取反应体系的图像，再提取图像的原始信息并进行处理，最终得到可用于定量的参数再进行浓度换算。根据图像色彩模式，图像的原始信息可分为RGB[13,19-20]、HSV[21-22]、CMYK[2,23]3种，其中，RGB模式的应用最广泛，本研究采用RGB色彩模式。该模式认为任一颜色可由红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)三原色合成，因此，任何颜色均可提取出R、G、B值，如白色的RGB为255、255、255，黑色的RGB为0、0、0。获得图像的原始R、G、B值后，关键在于确定用于浓度换算的参数。有研究者直接利用原始信息中某一分量，如R值或G值或B值作为定量参数[18-19,24-28]，或者对原始信息进行处理得到定量参数，如灰度[8,29-30]、欧式距离[1,13,31]等。但这些参数有局限性，使用单一分量仅适用于某些特定颜色的分析体系，且现有定量参数易受环境影响，从而限制了智能手机定量检测技术的应用推广。本文以蛋白质的检测为例，确定了一种新的用于图像比色的定量参数，提高了图像比色的准确性和适用性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾、氢氧化钠(分析纯，阿拉丁公司)；人血清蛋白(南岳生物制药有限公司)。分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，超纯水机(美国艾科浦国际有限公司)，LED屏(深圳神牛器材LEDP120c)，测光仪(苏州特安斯 TASI-8700)，华为610s手机、华为G9手机、华为P9手机、魅族NOTE2手机、小米红米手机、iphone4S手机、iphone6手机、中兴CV19手机。

图1 手机定量测试平台Fig.1 Quantitative test platform based on smart phone

图2 12种浓度蛋白质的反应体系照片Fig.2 Reaction system images of 12 protein concentrations

1.2 双缩脲试剂与标准溶液的配制

双缩脲试剂用超纯水配制，其余物质浓度：氢氧化钠0.6mol/L、酒石酸钾钠32mmol/L、碘化钾20mmol/L、硫酸铜12mmol/L。

标准溶液：利用生理盐水对人血清蛋白进行稀释，配成质量浓度分别为0、3.1、4.7、6.3、9.4、12.5、18.8、25、37.5、50、75、100g/L的白蛋白溶液。

1.3 实验过程

检测样本与双缩脲试剂的体积比为3∶100，将混合液装入干净的比色皿中，盖上硅胶塞。反应5min后，将其放置在手机图像采集位或利用分光光度计进行检测。

分光光度计：波长540nm。手机拍照设置：关闭闪光灯，自动白平衡，其他参数均设为自动。

智能手机采集装置见图1，其中图像采集位为六边形框，手机与图像采集位的距离可前后调整。LED屏置于图像采集位后方，可使比色皿各处的光照一致。

2 结果与讨论

2.1 实验参数的确定

以LED屏作为背景光源，将12个质量浓度的蛋白标准溶液依次加至检测液中，从低浓度至高浓度分别用S1～S12表示。反应后利用华为610s手机采集对应的图像，LED屏调节色温为4500K，亮度为18000Lux，拍摄距离为13cm。不同浓度的蛋白反应后会呈现不同的颜色，且颜色越深代表该样品的浓度越高(图2)。

利用Photoshop软件提取图像中比色皿的显色区域及其上方空白区域的R、G、B值。各有色区域的R、G、B值与空白区域的R0、G0、B0值见表1。

表1 比色皿显色区域与空白区域的R、G、B值Table 1 The values of R,G and B in chromogenic area and blank area of cuvette

图3 各分量(A)、灰度值(B)、特征吸光度(C)与质量浓度的线性关系Fig.3 Linear relationships between concentration and R,G,B components(A)，gray value(B),absorbance(C)

已有研究多利用三原色中某一分量值进行运算，本实验利用表1的各单一分量(y)与质量浓度(x,g/L)进行线性拟合(图3A)，发现G分量与质量浓度存在较好的线性关系，但不同颜色的反应体系，某一分量不能通用。将图像三原色按式(1)转换成灰度后可不受某单一分量的影响。

Gray=0.3R+0.59G+0.11B

(1)

将灰度值与质量浓度进行线性拟合(图3B)，结果显示灰度值可通用于不同颜色的反应体系，但其线性相关系数低于单用G分量拟合的相关系数。为进一步提高其线性相关性，将灰度值转换成特征吸光度。根据朗伯-比尔定律定量(公式2)，在一定范围内质量浓度与吸光度存在线性关系。图片中无法得到光强，但光强与灰度呈相关关系，光强越大，灰度值越高。直接利用灰度值替代光强，以比色皿上方空白区域的灰度值作为入射光强度，以比色皿有色区域的灰度值作为透射光强度。将灰度值经公式(3)转换成特征吸光度，即本文所确定的定量参数。

A=-lg(I/I0)=kbC

(2)

A=-lg(Gray/Gray0)

(3)

其中I为透射光强度，I0为入射光强度，k为物质的摩尔吸光系数，b为检测池厚度，C为物质的浓度，Gray为反应区域的灰度，Gray0为空白区域的灰度。

转换后特征吸光度与质量浓度的相关系数达0.998(图3C)，且通用于不同颜色的反应体系。将手机测试梯度与分光光度计测试梯度进行对比(图4)，发现手机的检测梯度小，但线性相关性与分光光度计相当。而分光光度法采用反应体系的最佳波长进行检测，且使用了强光源(氙灯或卤素灯)，其梯度更大，表明手机具有较好的检测性能，且相比于分光光度法，其成本更低、更便携，且各种颜色体系均可直接测试，无需设置特定波长。同时，由于利用比色皿空白区域作为对照，无需设置空白对照组即可进行检测。

图4 手机与分光光度计的检测梯度比对Fig.4 Comparison of mobile phone test gradients and spectrophotometer test gradients

2.2 检出限

将生理盐水作为空白样本，利用华为610s手机进行20次重复测试，得到空白样本的测试均值(AV)与标准差(SD)，按照检出限LOD=AV+2SD计算，得到该方法的检出限为0.21g/L。

2.3 不同手机品牌的测试

选取华为610s、华为G9、华为P9、魅族NOTE2、小米红米、iphone4S、iphone6、中兴CV198款手机进行血清蛋白浓度的检测，将获得的图像转换成特征吸光度进行处理，LED屏调节色温为4500K，亮度为18000Lux，拍摄距离为13cm。8款手机的参数及测试结果如表2所示。

表2 8款手机的参数及测试的线性关系Table 2 The parameters and linear correlations of 8 mobile phones

结果表明，采用不同品牌的手机检测不同浓度的蛋白标准液，均呈现良好的线性相关性，可用于定量检测。但各手机之间的测试梯度有明显区别，其中梯度最大的为中兴CV19，而其摄像头仅为30万像素，梯度最小的为华为P9，为双摄像头，线性相关系数最高的是华为610s。表明手机硬件与测试结果并无明显关联，可能是各手机内置的成像算法所致。

2.4 测试的重复性

利用华为610s作为检测手机，LED屏调节色温为4500K，亮度为18000Lux，拍摄距离为13cm。对11.8、31.1、85.4g/L的样本进行重复测试，每个质量浓度样本重复测试10次。相对标准偏差(RSD)分别为11.9%、4.6%、2.0%，该检测方法显示了较好的重现性。

对12.5、23.8、38.1、77.9g/L的样本进行同时检测，RSD分别为11.5%、3.5%、3.8%、2.2%，表明该检测方法可实现多样本的同时检测。

2.5 影响因素的考察

手机采集图像时，易受光照与拍摄距离等外界环境的影响。利用华为610s作为检测手机，固定色温为4500K，拍摄距离为13cm，利用LED屏模拟5种光照强度，以光照仪测试光照强度分别为7300、13000、18000、24500、34000Lux。考察了上述光照强度对高、中、低3种浓度样本检测的影响，并以光强18000Lux为对照。结果显示，高、中、低3种浓度样本在其他4种光照强度下的测试结果与对照的最大相对偏差分别为5.1%、-7.8%、-6.8%，光照强度对检测结果无明显影响。

固定光照强度为18000Lux，拍摄距离为13cm，考察了不同色温(3300、3900、4500、5000、5600K)对3种质量浓度样本检测的影响，并以色温4500K为对照。结果显示，3种质量浓度的样本在其他4种色温下的测试结果与对照的最大相对偏差分别为4.6%、-6.4%、-10.4%，表明色温对检测无明显影响。

图5 拍摄距离对测试的影响Fig.5 Influence of detection distance on mobile phone test

光照强度与色温对检测均无明显影响，是由于将图像RGB转换成吸光度时，读取了显色区域与空白区域的信息。光照对于显色区域与空白区域的影响一致，可相互抵消。

固定色温4500K，光照强度18000Lux，考察了88g/L的样本在13种不同拍摄距离(5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29cm)时的检测结果，以拍摄距离13cm为对照(见图5)。结果显示，其他拍摄距离下的测试结果与对照的最大相对偏差为-30.3%，在测试距离大于20cm后，测试结果呈明显偏差，且随着距离的增加偏差增大。可能是由于距离增加后，测试结果受到手机相机定焦的影响。实际应用时，需固定拍摄距离。

图6 定量检测的APP界面Fig.6 Interface of APP for quantitative detection

2.6 APP的比对试验

智能手机拥有强大的计算能力，因此开发APP应用，利用智能手机进行图像处理与运算，可直接进行定量检测。APP应用界面如图6所示。打开APP采集图像后，进行两次取值，第一次取值为空白区域的RGB值，第二次取值为显色区域的RGB值，点击计算，即可得到测试样本的浓度值。

利用华为610s作为检测手机，同时利用分光光度计分别对25个未知样本进行检测。测试结果显示，手机的测试值与分光光度计测试值的相关系数(r2)为0.969，两者测试结果相近，表明直接利用智能手机进行定量检测的结果可靠。

3 结 论

本文确定了一种新的图像比色参数，先将图像中比色皿的显色区域和空白区域的三原色转换成灰度值，再进一步转换成特征吸光度。该参数的通用性强，适用于不同颜色反应体系的检测，且光强与色温的影响小。利用手机APP可直接在手机上完成检测，重复性好、测试准确，且可以同时进行多个样本的检测。由于该方法的便携性与准确性，在食品、环境、健康的现场实时检测中有很大的应用前景。但该参数在不同手机上使用时存在差异，后期需优化以提高其适用性。