TRAIL协同五味子乙素对脑肿瘤干细胞生长的影响

王东东， 张 宇， 张玉影， 赵贵芳， 吕 鹏， 钟 越， 于洪泉， 齐 玲

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，恶性程度极高。调查研究显示：中国原发性脑肿瘤的发病率为22.52/10万。其中，胶质瘤占29.78%。并且，随着恶性肿瘤发病率的逐年攀升，恶性胶质瘤发病率的上升也最为明显[1，2]。因此，如何有效的控制甚至治愈胶质瘤是亟待解决的难题。研究表明，脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cells，BTSCs) 是脑肿瘤发生、复发及对放化疗产生抵抗的根源[3，4]，其缺乏有效的药物治疗。胶质瘤细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的敏感性不同，而五味子乙素(Schisandrin B，SchB)可抑制胶质瘤细胞的增殖[5，6]，但两者对BTSCs的作用不清，因此，有必要研究TRAIL和SchB对BTSCs增殖的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 Sch B(中国药品生物制品检定所)；DMEM/F12培养液、神经培养基、B27添加剂和小牛血清(美国Gibco公司)；TRAIL、人碱性成纤维生长因子(bFGF)和人表皮生长因子(EGF)(英国PeproTech公司)；木瓜蛋白酶(Worthington DBA，Freehold，NJ)；CD133免疫磁珠(Miltenyi Biotec)，二甲基亚枫(DMSO)和四甲基偶氮唑(MTT)(美国Sigma公司)。

1.2 细胞培养 取新鲜人脑肿瘤组织(病理诊断为Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤)，将组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入木瓜蛋白酶置于37 ℃水浴中消化45 min，300 g，350 r/min，离心5 min，加入卵类黏蛋白液3 ml终止反应，反复吹打过滤，300 g，350 r/min，速度离心5 min，加入红细胞去除液，摇床振荡10 min。离心后细胞中加入无血清培养液洗涤细胞(神经培养基含有EGF 20 μg/L、bFGF 20 μg/L、B27添加物)，再次离心后将细胞重悬培养液中，台盼蓝计数活细胞，以2×106/75 cm2密度将细胞接种于培养瓶中，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养12 h。

1.3 CD133免疫磁珠筛选BTSCs 将上述培养的肿瘤细胞在次日吹打混匀后70 μm滤器过滤，计数活细胞。分选缓冲液洗涤，800 g，900 r/min速度离心3 min，将沉淀加入300 μl分选缓冲液混匀，再加入100 μl CD133免疫磁珠，混匀后4 ℃避光孵育30 min，再加入缓冲液洗涤，以800 g，900 r/min速度离心10 min，弃上清，再用缓冲液重悬细胞。先用500 μl缓冲液冲洗分选柱，将细胞悬液过柱，缓冲液洗分选柱3次，移柱出磁场，1 ml缓冲液洗柱，用泵加压，收集洗液为CD133+细胞(即BTSCs)。

1.4 细胞增殖能力分析 机械分离BTSCs将其制成单细胞悬液，以5×103个/孔密度将其均匀接种于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养过夜。次日加入TRAIL(0、1、3、10、30和100 μg/ml)；Sch B (0、12.5、25、50和100 μg/ml)；TRAIL(0、1、3、10、30和100 μg/ml)联合Sch B(100 μg/ml)，每个浓度设5个复孔，药物作用24 h时，各孔再加入MTT 20 μl，继续在培养箱中孵育4 h，弃上清，每孔加入DMSO150 μl，振荡后在全自动酶标仪上测定各孔490 nm区的吸光度值，并依据公式计算细胞增殖能力=(A用药组/A对照组)×100%。

2 结 果

2.1 TRAIL影响BTSCs增殖 不同浓度TRAIL作用于BTSCs 24 h时，均可以抑制细胞的生长增殖，尤其30 μg/ml和100 μg/ml组细胞的增殖能力明显受到抑制，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

表1 TRAIL对BTSCs增殖能力的影响

与对照组比较：*P<0.01

2.2 Sch B影响BTSCs增殖 不同浓度Sch B作用于BTSCs 24 h时，均可以抑制细胞的生长增殖，尤其25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml组细胞的增殖能力均明显受到抑制，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 Sch B对BTSCs增殖能力的影响

与对照组比较：*P<0.01

2.3 TRAIL联合Sch B对BTSCs增殖的影响 不同浓度TRAIL联合100 μg/mlSch B作用于BTSCs 24 h时，均可以明显地抑制BTSCs 的生长增殖，与空白对照组比较，TRAIL浓度为30 μg/ml和100 μg/ml可抑制其增殖可达到50%以上，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 TRAIL联合Sch B对BTSCs增殖能力的影响

TRAIL浓度(μg/ml)细胞增殖率(%)对照组TRAIL组+SchB(100 μg/ml)组0131030100100.00±4.0887.67±7.3183.63±7.5081.75±4.6548.97±4.16∗42.85±4.76∗

与对照组比较*P<0.01

3 讨 论

2008年美国国家综合癌症网(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)统计近30年美国癌症，原发性恶性脑肿瘤发病率正呈逐年递增，年增长率约为1.2%，老年人群尤为明显。国内尚缺大规模流行病学调查。恶性胶质瘤确诊后首选手术疗法，术后结合放化疗等综合治疗。很多学者对恶性胶质瘤的化疗及放疗等进行了大量研究，进展不明显。近年，肿瘤生物学研究表明，脑肿瘤中存在一小群特殊的BTSCs，它们决定了脑肿瘤的发生、复发以及耐药与否[5，6]。

TRAIL凋亡传导途径是人体内重要的、天然的抗肿瘤途径，但大多数恶性胶质瘤细胞都存在TRAIL 抵抗现象[7，8]，甚至在初期用药敏感后还会再出现继发性耐药。因此，TRAIL耐药问题急需解决。胶质瘤发生耐药是由于BTSCs的存在[3，4]。此前我们在研究中发现，长白山特色药物五味子的主要成份Sch B可以抑制胶质瘤的体内外生长，并可以通过活化线粒体通路促进肿瘤细胞凋亡[9]。因此，TRAIL联合Sch B可能解决TRAIL耐药的问题。

我们原代培养了胶质瘤细胞后，应用CD133免疫磁珠分选法获得BTSCs。应用MTT法检测TRAIL、Sch B单独及联合作用对BTSCs增殖的影响发现：TRAIL和Sch B均可以浓度依赖性地抑制BTSCs的增殖作用，当两者联合作用时，可发生明显的协同作用。尤其在高浓度TRAIL与Sch B共同作用BTSCs后，可以抑制BTSCs的增殖达50%以上。以上结果说明，Sch B有可能解决TRAIL耐药问题，但其机制需进一步深入研究。