丹皮酚对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬和死亡的保护作用

王训翠，朱国旗，赖桂华，李庆林

(1.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，科研实验中心，安徽 合肥 230038；2. 安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 230032)

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是一种常见的神经系统变性疾病，其病理特征表现为多巴胺能神经元进行性缺失和多巴胺含量的减少。线粒体功能障碍和线粒体自噬异常可能是导致PD发病的关键分子机制之一[1]。最近的研究表明，线粒体自噬促进了神经退行性疾病的发生和发展[2]。在许多PD患者中，发现DJ-1基因发生突变，DJ-1缺失会导致氧化应激增加，parkin募集和线粒体自噬增多[3]。研究还发现在PD患者中，错误折叠和聚集的α-突触核蛋白(α-synuclein)对神经细胞具有毒性作用，这种毒性与线粒体自噬增强有关[4]。这些研究报道表明调控线粒体自噬水平，特别是抑制线粒体自噬的过度发生，稳定线粒体结构和正常功能显得尤为重要。丹皮酚(paeonol, Pae)是从毛茛科植物牡丹根皮和萝摩科植物徐长卿干燥根或全草中提取出来的主要活性成分。作者此前的研究已证实，丹皮酚在一定浓度范围内通过阻止谷氨酸或1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridine, MPP+)诱导的神经细胞线粒体功能损伤，抑制线粒体氧化应激的发生，维持细胞内线粒体功能稳定，发挥对PD细胞模型的神经保护作用[5-6]。但丹皮酚是否能抑制神经毒性药物诱导的线粒体自噬，发挥神经保护功能尚不清楚。本课题采用MPP+作用于SH-SY5Y细胞，建立PD体外模型，探讨丹皮酚通过调控线粒体自噬水平发挥神经保护作用的可能机制，为防治PD提供更多的实验基础。

1 材料

1.1药物与试剂丹皮酚(批号20130412，纯度>99%)由安徽中医药大学科研实验中心提供；雷帕霉素(rapamycin，Rap)、丹酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)，均购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基(美国Gibco)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，美国Hyclone)；线粒体特异性荧光探针(Mito-Tracker Green)、ECL试剂盒、溶酶体特异性荧光探针(Lyso-Tracker Red)(上海碧云天)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(南京建成)；兔抗parkin、微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、Beclin-1多克隆抗体(Cell Signaling Technology)；鼠抗GAPDH单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)；其余试剂均为分析纯。

1.2细胞株人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，购自美国细胞菌种库(ATCC)。

1.3仪器MCO-175型CO2培养箱(日本三洋)；JEM-1230型透射电子显微镜(日本电子)；SW-CJ-1F型超净工作台(苏州安泰)；DBI6000倒置荧光显微镜、FC500型流式细胞仪(美国Beckman)；电泳及转印系统(美国Bio-Rad)；TCS SP5型激光共聚焦显微镜(德国Leica)；Alpha FluorChem FC3 化学发光系统(美国Alpha)。

2 方法

2.1细胞培养和处理SH-SY5Y细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中孵育，每2～3 d换液1次。取对数生长期SH-SY5Y细胞，调整细胞浓度后，根据实验需要分别接种于96孔板或6孔板，待细胞贴壁过夜后，按实验要求加入不同药物进行处理。将细胞分为正常对照组、MPP+(1 mmol·L-1)处理组和丹皮酚(10 μmol·L-1)处理组。实验另设雷帕霉素(1 μmol·L-1)处理组。正常对照组加入等体积的DMEM培养基；MPP+组和雷帕霉素组加入终浓度分别为1 mmol·L-1MPP+和1 μmol·L-1雷帕霉素的等体积培养基；丹皮酚组预先1 h加入10 μmol·L-1丹皮酚，再加入1 mmol·L-1MPP+处理细胞24 h。

2.2MTT法检测细胞存活率取对数生长期的SH-SY5Y细胞，消化收集后，以5×107·L-1的细胞密度接种于96孔板，每孔100 μL，培养过夜，待细胞贴壁良好后分组加药。给药组加不同浓度的丹皮酚溶液，终浓度依次为1、10、100 μmol·L-1，预保护1 h后，再加入1 mmol·L-1MPP+处理细胞24 h，实验另设正常对照组，每组8个复孔。37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，每孔加入5.0 g·L-1MTT 20 μL，培养箱中继续培养4 h，吸弃全部上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡20 min。用酶标仪(波长490 nm)记录每孔的吸光度(A)。细胞存活率/%=(实验组A值/正常对照组A值)×100%，实验重复3次。

2.3LDH法检测细胞损伤度SH-SY5Y细胞经不同药物分组处理24 h后，每组吸取6个复孔各50 μL培养上清液，按照LDH试剂盒说明书操作，用酶标仪记录波长340 nm处的吸光度(A)，测定各组LDH的释放度。

2.4MDC染色流式细胞仪检测自噬水平SH-SY5Y细胞经药物处理后，弃上清液，PBS洗3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定10 min，弃上清液，每孔加入终浓度为50 μmol·L-1MDC染液，于37℃培养箱中再温育30 min，用紫外激发，在倒置荧光显微镜下观察摄片。另外再用PBS重悬细胞，于流式细胞仪上检测，平均荧光强度表示细胞内酸性自噬泡的数量。WinMDI2.9软件分析结果。

2.5透射电子显微镜检测线粒体自噬现象SH-SY5Y细胞经分组处理48 h后，1 000 r·min-1离心5 min，收集细胞，弃上清；用预热37℃的PBS洗涤细胞；倾斜离心管，沿管壁缓缓加入2 mL预冷的1%戊二醛，4℃固定2 h后，1%锇酸固定1 h；丙酮梯度脱水；浸透，包埋，聚合，超薄切片；醋酸铀及枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜观察并拍照。

2.6激光扫描共聚焦显微镜检测亚细胞共定位采用荧光共振能量转移技术检测线粒体自噬活性, 用荧光探针Mito-Tracker Green标记线粒体,荧光探针Lyso-Tracker Red标记溶酶体, 经激光共聚焦显微镜分析溶酶体对线粒体的吞噬活性。SH-SY5Y细胞以1×108·L-1接种于6孔板,待细胞70%～80%融合时，进行药物处理24 h,每孔加入37℃预热的75 nmol·L-1Lyso-Tracker Red,15 min后再加入100 nmol·L-1Mito-Tracker Green, 45 min后，用PBS漂洗3次，置激光扫描共聚焦显微镜下分析检测。

2.7Westernblot检测自噬相关蛋白的表达细胞经分组处理24 h后，细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。每组样品总蛋白25 μg经12% SDS-PAGE电泳，分离蛋白。将分离胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉常温封闭3 h后，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育过夜。PBST漂洗3次，每次10 min，二抗常温孵育2 h，再PBST漂洗3次，每次10 min，然后加入ECL发光底物，暗室下X线片曝光。蛋白条带用化学发光系统分析，采用平均灰度值比较各组蛋白的表达。

3 结果

3.1丹皮酚对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率和损伤度的影响Fig 1的MTT检测结果显示，神经毒性药物MPP+诱发了SH-SY5Y细胞的死亡，与空白对照组比较，MPP+处理组细胞的存活率明显降低，而预先加入不同浓度丹皮酚处理后，细胞存活率明显增加(P<0.05)，细胞存活率与丹皮酚的给药浓度呈一定的量效关系。

神经细胞在损伤的过程中，LDH会释放到培养上清液中，上清液LDH漏出率反映出细胞损伤或死亡程度。Fig 2的LDH检测结果表明，MPP+处理组细胞培养液中LDH漏出率明显高于正常对照组(P<0.01)；而丹皮酚与MPP+共同孵育24 h后，细胞上清液中的LDH漏出率明显下降，并随着浓度的增加，作用逐渐增强，细胞受损程度明显减轻。结果表明MPP+诱导了SH-SY5Y细胞的死亡，丹皮酚的保护作用呈浓度依赖性。

Fig 1 Effect of paeonol on MPP+-inducedcell viability in SH-SY5Y

Fig 2 Effect of paeonol on MPP+-inducedLDH leakage in SH-SY5Y

3.2丹皮酚对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞自噬活性的调控细胞经不同浓度的MPP+处理24 h后，倒置显微镜下观察发现细胞突起结构明显减少，多呈梭形，贴壁较差，培养液中可见部分漂浮细胞。细胞内出现大量空泡，随着MPP+作用浓度的不断增加，细胞内空泡数目逐渐增多。而正常对照组细胞数目明显增多，细胞贴壁良好，具有多只长短不等的突起，并出现簇状生长(Fig 3)。

Fig 3 Induction of autophagic vacuoles inSH-SY5Y cells treated with MPP+(×200)

细胞经MDC染色后，置荧光显微镜下观察，与正常对照组相比，1 mmol·L-1MPP+作用SH-SY5Y细胞24 h后，细胞内荧光信号明显增强，并出现亮绿色荧光点状聚集，提示MPP+处理组细胞内出现大量自噬空泡聚集，自噬被激活；雷帕霉素处理组细胞状态接近于MPP+处理组；而正常对照组细胞发出均匀的淡绿色荧光，丹皮酚处理组细胞荧光染色信号出现明显降低，仅见很少量的MDC阳性细胞(Fig 4)。

3.3丹皮酚干预对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞自噬比率的影响细胞经不同药物处理后，通过MDC染色，经流式软件检测MDC阳性细胞的比率。如Fig 5所示，与正常对照组相比，MPP+处理组和雷帕霉素组平均荧光强度增加，出现峰右移，平均荧光强度(median fluorescence intensity，MFI)值分别为(88.8±3.3)%和(84.9±2.6)%，表明细胞内自噬泡(autophagic vacuole，AVO)明显增多(P<0.01)，提示细胞自噬的发生。丹皮酚处理组相较于MPP+处理组，其MFI值降为(64.9±3.2)%，显示荧光信号减弱，表明细胞内自噬比率明显降低。

Fig 4 Effect of paeonol on MPP+-induced AVOs formation in SH-SY5Y cells(×200)

Fig 5 Effect of paeonol on MPP+-induced autophagy formation in SH-SY5Y

Fig6EffectofpaeonolonMPP+-inducedmitophagyinSH-SY5Ycells(×15 000)

A:Control;B:MPP+;C:Pae.Arrows indicate mitophagy.

3.4丹皮酚干预对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬现象的影响电镜是观察自噬的“金标准”，自噬发生的超微结构特征为，双层膜或多层膜包绕的大小不一的泡状小体，也称为自噬泡。如Fig 6所示，MPP+处理组细胞核内染色质凝聚，细胞内出现大量自噬空泡聚集，部分空泡内可见内容物，线粒体结构紊乱且多空泡化，并有部分线粒体被包裹进囊泡里，且线粒体数目明显减少；正常对照组细胞表现结构清晰，核染色质分布均匀，各细胞器形态正常；丹皮酚处理组胞质内未见明显空泡，细胞形态结构均接近于正常对照组。

3.5丹皮酚干预对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬活性的影响细胞经处理后，观察MPP+诱导的自噬体结构、分布的改变及亚细胞共定位情况。激光共聚焦显微镜下可见绿色为线粒体探针标记在特定激光下显影，红色为溶酶体探针标记在特定激光下显影。经激光共聚焦显微镜软件分析后,两者立体空间不重合时仍为红色或绿色；当红绿荧光立体空间重合时表现为黄色，即溶酶体吞噬线粒体后尚未降解前，红色和绿色共定位呈现为黄色标记。MPP+处理组可见较多的黄色标记，而正常对照组未见明显的黄色标记,丹皮酚处理组仅有少量黄色标记(Fig 7)。

3.6丹皮酚干预对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬水平的调控如Fig 8所示，与正常对照组相比，MPP+处理组自噬相关蛋白Beclin-1的表达明显上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加，parkin蛋白表达水平下降，预先经丹皮酚处理后能明显抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬水平。提示丹皮酚可能减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体自噬的发生。

Fig 7 Colocalization of with Green-Mito with Red-Lyso(×200)

Fig 8 Effect of paeonol on MPP+-induced mitophagy related-proteins in SH-SY5*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.01,##P<0.01 vs MPP+

4 讨论

有研究表明，线粒体的功能和特征使得选择性易受损的神经元从本质上对老化和应激的敏感性增高[7]。线粒体功能障碍在神经变性疾病发病机制中起着重要作用，线粒体已经成为神经变性疾病的轴合点。事实上，线粒体自噬可能是把“双刃剑”，在不同的病理情况下其发挥作用也不同。在脑缺血/再灌注大鼠模型中，重度高血糖抑制线粒体自噬水平，导致受损线粒体堆积，引发下游的凋亡反应[8]，此时线粒体自噬发挥着保护作用。另有研究表明[9]，PD患者脑部解剖发现自噬泡样的物质出现在多巴胺能神经元内。本实验中发现，MPP+作用SH-SY5Y细胞24 h后，神经细胞数目明显减少，细胞活性明显下降，LDH释放值明显增加。细胞内出现大量的空泡，经MDC染色为自噬泡。研究还发现，MPP+能激活细胞内线粒体自噬水平，引起神经细胞缺失或死亡，提示线粒体自噬在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中发挥着损伤作用。最新研究报道，丹皮酚对不同作用下自噬的调节机制也截然不同[10-11]。在apoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，丹皮酚通过诱导自噬，抑制平滑肌细胞的增殖；而在动脉粥样硬化细胞模型中，丹皮酚通过抑制自噬，拮抗氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤。本研究发现，预先加入丹皮酚作用后可以逆转MPP+诱导的线粒体自噬过度激活，保护损伤的神经细胞。进一步验证了不同病理机制下丹皮酚发挥的作用也不完全相同。

LC3是自噬体膜上的标记蛋白，当细胞内自噬被激活时，LC3-Ⅰ转变成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ的含量与自噬空泡的数目呈正比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值常用来衡量细胞自噬活性[12]。Beclin-1是形成自噬体的必需分子，与多种蛋白反应调控自噬体形成与成熟。本研究发现，1 mmol·L-1MPP+作用SH-SY5Y细胞24 h后，自噬标记蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达均明显增加，MDC染色显示，细胞内酸性自噬泡数目明显增多，经电镜观察发现存在线粒体自噬现象。丹皮酚干预后，线粒体与溶酶体共定位数量减少，细胞内线粒体自噬活性降低，自噬水平出现下降。

线粒体功能障碍在PD的发生中至关重要，其正常功能的维持常需关键分子——parkin[13]。parkin过表达能够抑制活性氧(reactive oxidative species, ROS)的生成，阻止线粒体膨胀和细胞色素C的释放，增强线粒体膜电位和复合物的选择性表达，在PD的动物模型发挥保护作用[14]。而在parkin缺陷的小鼠中，细胞氧化应激水平升高，纹状体分离的线粒体呼吸能力降低[15]。这些研究表明，parkin、线粒体自噬与PD之间存在着紧密的联系。本实验结果显示，MPP+导致了parkin蛋白的表达水平明显下调。细胞内下调的parkin蛋白可能会导致其蛋白E3泛素连接酶功能的改变，导致体内错折叠蛋白积聚，受损线粒体累积。其功能丧失还会引起线粒体自噬调节的异常，导致PD[16]。丹皮酚能上调MPP+诱导的parkin蛋白表达，阻止线粒体自噬应激的发生，稳定线粒体功能，保护神经细胞。

通过本实验，并结合前期研究证实，丹皮酚可能从线粒体途径保护MPP+损伤的PD细胞模型。一方面，丹皮酚属于异黄酮类化合物，具有很强的抗氧化性，能降低MPP+诱导的ROS含量，减轻线粒体氧化应激反应，提高MPP+诱导的线粒体自噬对功能失常线粒体的清除，使得细胞内各细胞器的功能恢复正常状态；另一方面，丹皮酚可能通过抑制MPP+诱导的线粒体自噬应激，稳定线粒体自噬水平，保护线粒体功能，阻止后期凋亡的的发生。然而，丹皮酚增强线粒体自噬对失常细胞器的降解或抑制过度的线粒体自噬发挥神经保护作用尚需深入研究。

本实验结果提示，MPP+诱导了细胞的损伤，并且激活线粒体自噬，破坏了线粒体自噬的稳态，导致线粒体氧化应激损伤和线粒体功能障碍，实验中MPP+损伤的SH-SY5Y细胞在24 h发生了线粒体自噬，当不能正常清除损伤线粒体时，则在48 h发生凋亡[5]。丹皮酚能抑制MPP+诱导的线粒体自噬，保护神经细胞死亡。但丹皮酚是如何调节线粒体自噬与细胞凋亡之间的关联性而发挥的神经保护作用，有待于进一步研究。

(致谢：本实验是在安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室和科研实验中心完成，感谢实验室老师的指导与帮助。)