大鼠低氧性肺动脉高压肺血管重构模型的构建及肺组织中miR－34a的表达※

马 兰，刘川川，周 振，宋泽青，刘 洁，格日力*

(1.青海大学医学院高原医学研究中心，青海西宁810001;2.青海省高原医学应用基础重点实验室，青海西宁810001;3.青海大学医学院临床医学系，青海西宁810001)

低氧性肺动脉高压(Hypoxic Pulmonary Hypertension，HPH)是高原适应生理的重要表现，而显著的肺动脉高压又是慢性肺源性心脏病和各型高原病(高原肺水肿、高原红细胞增多症、高原心脏病等)发病的重要病理生理变化之一，是一种潜在的早期高原病，且病情越重，HPH越明显。在慢性HPH形成早期，肺血管收缩是主要因素，随着缺氧时间的延长，肺血管结构重建也参与其中，低氧性肺血管结构重建(hypoxic pulmonary vascular remodeling，HPVR)是慢性HPH的重要病理生理基础。然而，目前HPH的发病机制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度只有～23nt的内源性非编码单链RNA，在动物种系发生中具有保守序列，在基因表达的调控中发挥重要作用。近年来，miRNA在肺动脉高压肺血管重塑中的作用备受关注，并且对于miRNA与HPH的研究越来越受到重视。越来越多的研究表明，miRNA有望作为肺动脉高压治疗的新靶点。miR－34a是一个有多种功能的miRNA，在许多疾病的病理生理中发挥着重要作用。最新研究显示［1］，miR－34a在多种心血管疾病中存在异常表达。还有研究报道［2］，miR－34a在干细胞分化为平滑肌细胞过程中显著升高，并发现miR－34a在促进平滑肌细胞分化中起重要作用。另有研究也已证实P53能够显著地诱导miR－34a的转录，且P53基因敲除的小鼠在低氧诱导下易发生HPH及肺血管重构［3］。

本研究旨在观察随着HPH肺血管重建过程中肺组织miR－34a和P53基因的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择

从北京维通利华实验动物技术有限公司订购雄性SD大鼠40只，体重140～160 g(动物合格证号:11400700115390)。运回西宁后随机分为常氧对照组和低氧第1 wk组、第2 wk组和第3 wk组，每组10只。

1.2 实验试剂及仪器选择

Rn－miR－34a primer(MS00000224)、Rn－U6 primer(MS00033740)、P53 primer QT00193522、18sRNAPrimer(QT00199374)、miScript II RT kit、miScript SYBR Green PCR kit及QuantiFast SYBR Green PCR kit均购自Qiagen公司;Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒购自TIANGEN公司，Anti－P53兔多克隆抗体、Anti－a－tubulin兔多克隆抗体及二抗均购自Abcam公司，BCA蛋白定量试剂盒和ECL发光试剂盒均购自Pierce公司。

MP150十六导生理记录仪购自美国Biopac公司，ABI7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，AI 600成像仪购自美国GE公司，石蜡切片机购自德国Leica公司。

1.3 低氧性肺动脉高压动物模型构建

将低氧组SD大鼠置于青海大学高原医学研究中心低压氧舱(模拟海拔5000m)，构建随时间推移低氧性肺动脉高压肺血管重建的实验动物模型，分别在低氧第1、2、3周取材并进行各项指标的检测。正常对照组在低压氧舱外正常饲养。

1.4 生理学和血流动力学指标的测定

分别在低氧处理的第1、2和3周，用10%乌拉坦腹腔内注射麻醉(10mg/kg)大鼠，其颈前皮肤用75%的酒精消毒后，切开游离右侧颈外静脉。将一个充盈0.1%肝素盐水的7号Swan－Ganz管从右侧颈外静脉插入，并缓慢将其推至右心室然后进入肺动脉，测平均肺动脉压;导管另一端连接压力换能器，将信号输入16导生理信号采集系统，根据压力图形判断插管位置，以监测实验动物的肺动脉压的变化。

1.5 心脏重量、左右心室重量比的测定及取材

待测定完上述相关生理指标后，将大鼠放血处死，迅速打开胸腔，取出心脏称重，剪去右心房组织，沿室间隔边缘剪下右心室，分别称取右心室游离壁(RV)和左心室与室间隔(LV+S)重量，计算RV/(LV+S)重量比，作为右室肥大指标。同时，取大鼠左侧肺组织，用4%的多聚甲醛固定，用于形态学测定;取出右肺组织，剪成小块组织后迅速保存在液氮中，用于分子生物学研究。

1.6 大鼠肺组织的HE染色

将固定好的肺组织常规脱水、石蜡包埋、切片(4μm)，用苏木素－伊红(HE)进行染色，观察不同低氧时间下肺小动脉形态学变化特征并拍照。

1.7 肺组织中总RNA的提取

从液氮中取出保存的肺组织块，准确称取50 mg，按照Trizol试剂盒说明书，一步法提取各组大鼠肺组织总RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度计测定A260和A280纯度及浓度、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析检测完整性。

1.8 肺组织中miR－34a表达水平的检测

取上述总RNA 2μg，严格按照miScriptII RT kit试剂盒说明书合成cDNA第一链。以此cDNA链为模板，严格按照miScript SYBR Green PCR kit试剂盒说明书，建立miR－34a和内参U6的反应体系，且每个样本均设三个复孔。在ABI7500荧光定量PCR上进行PCR反应，条件为(1)95℃，5 min;(2)95℃，10 sec，55 ℃，15 sec，60 ℃ 30 sec，40 个循环;(3)熔解曲线的采集在以上PCR反应结束后，以每10 sec上升0.5℃的速度从60℃到95℃来记录线。

1.9 肺组织中P53 mRNA水平的检测大鼠

取上述总RNA 2μg，严格按照FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。并以此cDNA第一链为模板，严格按照QuantiFast SYBR Green PCR kit试剂盒说明书，建立P53和内参18s rRNA的反应体系，且每个样本均设三个复孔。然后在ABI7500荧光定量PCR上进行PCR反应，条件为(1)95℃，5 min;(2)95℃，10 sec，60℃，30 sec，40个循环;(3)熔解曲线的采集在以上PCR反应结束后，以每10 sec上升0.5℃的速度从60℃到95℃来记录线。

1.10 肺组织中P53蛋白水平的检测

从液氮中取出保存的肺组织，各称取50 mg，加入一定比例的RIPA裂解液(含1mM的PMSF)，匀浆并提取肺组织总蛋白。用BCA蛋白定量法测定组织样本总蛋白浓度，每个样品取20μg上样，在5%浓缩胶和10%聚丙烯酰胺分离胶中进行电泳，电泳结束后用 Bio－Rad半干电转仪(恒压10V，20～30min)转到PVDF膜上。用新鲜配制的5%的脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入 P53兔多克隆抗体(1:2000)、抗α－tubulin兔多克隆抗体(1:2000)过夜(4℃)。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入羊抗兔HRP标记的二抗，室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min，用ECL发光液发光，用成像仪进行荧光成像并拍照。用P53目的条带与内参α－tubulin条带的灰度值之比作为P53蛋白的相对表达量，并用Quantity one分析软件进行灰度值分析。

1.11 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料用珋x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 右心室比重和平均肺动脉压

结果如表1所示，随着低氧处理时间的延长大鼠平均肺动脉压(mPAP)明显增加，与常氧对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.001)。且右心室占全心的比重RV/(LV+S)也明显增加，差异有统计学意义(P＜0.001)，提示随着低氧时间延长，大鼠肺动脉压逐渐增高并伴有右心室肥厚的表现，说明随着在低压氧舱中缺氧时间的延长，低氧性肺动脉高压动物模型基本构建成功。

2.2 肺小动脉形态学特征

如图1所示，随低氧时间的延长大鼠肺小动脉壁逐渐增厚(图中黑色箭头所示)，尤其是中间平滑肌细胞增殖明显，显示我们利用低压氧舱模拟海拔5 000 m构建低氧性肺动脉高压肺血管重建的模型成功。

表1 低氧处理组和对照组右心室比重和平均肺动脉压的比较结果(±s)Table 1 Comparison of RV/(LV+S)and mPAP among hypoxic groups with control(±s)

表1 低氧处理组和对照组右心室比重和平均肺动脉压的比较结果(±s)Table 1 Comparison of RV/(LV+S)and mPAP among hypoxic groups with control(±s)

*:P＜0.001 Vs对照组.

组别 n RV/(LV+S) mPAP(mmHg)对照组 10 0.27±0.04 10.99±2.53低氧 1wk 组 10 0.41±0.05*32.67±3.28*低氧 2wk 组 10 0.53±0.04* 32.11±8.88*低氧 3wk 组 10 0.55±0.06* 40.38±3.74*F 71.903 38.543 P 0.000 0.000

图1 大鼠肺组织HE染色图(×200)Figure 1 The HE staining of lung among hypoxic groups and control group

2.3 miR－34a在不同低氧大鼠肺组织中的表达情况

达量随着低氧时间的延长在2wk和3wk明显增高，差异有显著性(P＜0.05)。

结果如表2所示，大鼠肺组织中miR－34a的表

表2 qPCR法检测各组肺组织中miR－34a的相对表达量(±s)Table 2 Relative expression of miR－34a in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

表2 qPCR法检测各组肺组织中miR－34a的相对表达量(±s)Table 2 Relative expression of miR－34a in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

*:P＜0.05 Vs 常氧对照组.

组别 n 2－△△Ct常氧对照组 10 1.00±0.08低氧 1wk 组 10 0.93±0.03低氧 2wk 组 10 1.72±0.16*低氧 3wk 组 10 2.32±0.26*F 16.232 P 0.000

2.4 P53基因在不同低氧大鼠肺组织中的表达情况

2.4.1 各组大鼠肺组织中P53 mRNA的表达

结果如表3所示，在低氧1wk开始P53 mRNA表达开始增加，低氧3wk的表达量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 qPCR法检测各组肺组织中P53mRNA的相对表达量(±s)Table 3 Relative expression of P53 mRNA in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

表3 qPCR法检测各组肺组织中P53mRNA的相对表达量(±s)Table 3 Relative expression of P53 mRNA in lung tissues of rats in each group by qPCR(±s)

*:P＜0.05 Vs常氧对照组.

组别 n 2－△△Ct常氧对照组 10 1.00±0.11低氧 1wk 组 10 1.20±0.15低氧 2wk 组 10 1.39±0.17低氧 3wk 组 10 1.50±0.23*F 1.876 P 0.163

2.4.2 各组大鼠肺组织中P53蛋白的表达

结果如图2、表4所示，与常氧对照组相比，低氧各组大鼠肺组织中P53蛋白的表达明显增高，尤其是在低氧2wk和3wk时显著增高，差异有显著性(P＜0.001)，这一结果与mRNA的表达水平是一致的。

图2 Western blot法检测各组大鼠肺组织中P53蛋白水平表达图Figure 2 Expression of P53 protein in lung tissue of rats in each group by Western blot

表4 各组大鼠肺组织中P53蛋白水平相对表达量的比较(±s)Table 4 Comparison of the relative expression of P53 protein in the lung tissue of rats in each group( ±s)

表4 各组大鼠肺组织中P53蛋白水平相对表达量的比较(±s)Table 4 Comparison of the relative expression of P53 protein in the lung tissue of rats in each group( ±s)

*:P＜0.001Vs常氧对照组.

组别 n P53/α－tubulin 灰度值常氧对照组 10 0.27±0.07低氧 1wk 组 10 0.36±0.07低氧 2wk 组 10 0.68±0.07*低氧 3wk 组 10 1.14±0.09*F 26.775 P 0.000

3 讨论

高原环境有许多不利于人的因素，尤以低氧最为严重。长期生活工作在高原的人即使度过最初的不适应阶段，但随着时间的延续可产生代偿性的系列反应，少数人可产生严重的器官病理改变，导致所谓的“慢性高原病”。HPH是慢性高原病的一种常见病，其主要病理化特征是缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)和肺血管结构重构(hypoxic pulmonary vessel remodeling，HPVR)［4］。在肺血管重构过程中，肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增生肥大，细胞外基质合成增多，非肌型动脉肌化形成肌型动脉及外膜成纤维细胞增殖等导致肺小动脉管壁变厚、内径变窄，最终使肺血管阻力持久升高，造成持续性肺动脉压力升高［5］。如果长期持续的肺动脉高压得不到有效缓解，容易引发右心室代偿性肥厚，严重者甚至发展为右心衰竭。因此，研究 HPH的发病机理，对防治与其相关的心肺疾病具有重要的临床意义。

有效制备HPH动物模型是研究HPH分子机制的关键环节之一。然而，目前国内研究HPH制作动物模型的方式多采用间断常压低氧、持续常压低氧、间断低压低氧等方法［6］，主要是采用自制的小型舱体，用氮气、二氧化碳及氧气等混合后通过控制气体流量使氧流量控制在10%左右，即为常压低氧;或者用小型真空泵抽出舱内空气从而达到预设的低氧条件，即低压低氧。然而，上述方法的缺点在于舱体太小，动物样本有限，氧浓度的维持时间和准确度较难控制。在本课题研究中，我们采用全自动数控的大型低压氧舱来模拟高原，24 h全程自动化调控，保持一定的海拔高度，避免了人为操作误差导致的氧浓度不准确。由于缺氧方式和时间不同，造成的肺动脉高压模型也不同。因此，这种造模方法更接近于高原低压低氧环境的暴露。

本实验中，我们采用大型低压氧舱模拟海拔5 000 m，分别在低氧1、2、3周后用颈外静脉插管法测定mPAP来观察肺动脉压力情况;用RV/(LV+S)来评定右室肥厚;并用肺组织形态学观察肺小动脉重建情况，从而判定HPH肺血管重建动物模型是否构建成功。我们的研究结果显示，在低氧第1周开始，mPAP明显增加，右心室也有肥厚的表现，而从肺组织切片中并没有明显的肺小动脉壁增厚的表现，提示在低氧1周时大鼠肺动脉压力升高，但是并没有肺血管重建的形成。说明在缺氧早期肺动脉压力的升高主要是以肺血管收缩为主，且右心室出现生理代偿性肥厚，这是一种代偿反应，即通过肺血管收缩引起肺动脉压力升高从而达到最佳适应。然而，随着低氧时间的延长，在第2周和第3周不仅表现在mPAP的显著升高和右心室的肥厚，肺小动脉壁也明显增厚，出现了明显的肺血管重建。提示在低氧第2～3周即可成功构建出HPH肺血管重建动物模型。

近年来的研究发现［7］，缺氧环境下miRNAs表达改变能调节肺动脉平滑肌细胞增殖、凋亡、迁移等功能，并参与缺氧肺动脉高压的形成。因此，对于miRNAs与低氧性肺动脉高压的研究越来越受到重视。Caruso等人［8］用基因芯片技术在缺氧造成的肺动脉高压大鼠肺组织中筛选得到上百个miRNAs的表达，且体外实验已证实，miR－21［9］、miR－204［10］、miR－26a［11］、miR－24［12］以及 miR－146a［13］等可直接诱导血管平滑肌增殖，并且参与血小板衍生生长因子(PDGF)、骨形成蛋白(BMPs)等促增殖因子引起的细胞增殖。相反，另一些miRNAs，如miR－143和miR－145 等［14、15］具有抑制平滑肌细胞增殖的作用并可显著抑制血管平滑肌细胞表型转变和受损血管的重构。而miR－34a因具有调控细胞周期及细胞凋亡的作用而备受关注。特别是在肿瘤研究中，调控细胞周期进而影响细胞增殖、凋亡、衰老等过程。然而，有学者研究了miR－34a在干细胞分化平滑肌细胞中的作用时，发现miR－34a可促进小鼠和人胚胎干细胞分化为血管平滑肌细胞，提示miR－34a在血管平滑肌细胞中可能有重要功能［2］，有学者在此基础上进一步研究发现［16］，miR－34a能够调控血管平滑肌细胞表型转化，即抑制血管平滑肌细胞表型转化后的增殖及迁移能力，且在血管损伤修复及重塑中发挥重要作用。而我们的研究结果发现，在随着低氧时间延长，HPH肺血管重建逐渐形成的过程中，大鼠肺组织中的miR－34a的表达逐渐增高，提示miR－34a可能在HPH形成过程中发挥着重要的作用。已有研究证实，P53能够显著地诱导miR－34a的转录，且P53基因敲除的小鼠在低氧诱导下易发生HPH及肺血管重构［3］。我们的研究结果显示，随着低氧时间延长，HPH肺血管重建逐渐形成的过程中，大鼠肺组织中 P53基因不仅在mRNA水平，而且在蛋白水平表达也显著增高，这与彭利静［17］等人的研究结果是一致的，提示在HPH肺血管重建过程中miR－34a可能受P53基因的调控和表达。因此，通过本实验研究，我们推测miR－34a可能参与了HPH肺血管重建的过程，其调控机制尚待进一步研究探索。