慢性低氧对小鼠骨髓有核红细胞分化与凋亡的调控作用※

廖 瑜，王 玮，2，冯 琳，2，汤 锋，3* ，格日力，3#

(1.青海大学高原医学研究中心，青海西宁810001;2.青海大学医学院临床医学系，青海西宁810001;3.青海－犹他高原医学联合重点实验室，青海西宁810001)

高原红细胞增多症(High altitude polycythrmia，HAPC)的已知病理机制是慢性低氧刺激机体过度的红细胞增生加重器官缺氧和损伤。红系造血过程是一个动态过程，以自我更新和分化为主，主要是红系干祖细胞的增殖分化以及晚期红系的分化。其中在红系干祖细胞阶段CD34(跨膜磷酸糖蛋白)通常被认为是一个重要的标记物［1］。

CD34+HSC是初期的造血祖细胞，并且具有很高的增殖潜力［2－3］。而 CD71可以认为是早期的红系祖细胞过渡为晚期红系细胞过程中选择性高表达的一个标记物。Ter119主要标记自早幼红细胞分化至成熟红系阶段的细胞。CD71和Ter119常被用以标记红系在体内的动态成熟过程［4］。低氧条件刺激CD34+细胞的增殖并且发现BFU－E的比率也显著增高，说明低氧也能够刺激 CD34+细胞的分化［5］。洪欣等［6］在 2003年研究证实，在 1%低氧条件可以促进CD34+HSC的凋亡。目前低氧对于小鼠骨髓内CD71+和TER119+的影响尚缺乏实验数据，本研究拟做相关研究。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

选用雄性BALB/c小鼠(许可证号:SCXK2017－0001)，随机将12只小鼠分为慢性低氧组和高海拔对照组。慢性低氧组小鼠造模参考文献于青海大学低压氧仓(模拟海拔5500米)饲养30天(以下简称低氧组)。高海拔对照组小鼠在青海西宁(海拔2260米)饲养30天(以下简称对照组)。两组小鼠取血后，采用全自动生化分析仪行血液学分析。

1.2 骨髓单个核细胞制备

依据文献［8］使用小鼠骨髓单个核细胞提取试剂盒(购自天津灏洋公司)制备小鼠骨髓的单个核细胞。使用试剂盒中的F液冲洗出小鼠骨髓至离心管，用完全培养基重悬至6 mL。将细胞悬液按1:1的比例叠加于分离液上离心(2000r/min，25min)。吸出中间白色层的单个核细胞后，使用清洗液离心两遍后备用。

1.3 小鼠骨髓单个核CD71+细胞比率检测

用流式细胞术检测小鼠骨髓单个核CD71+细胞比率。分离出两组小鼠的骨髓单个核细胞分别计数后取出1×106个细胞，加入100μL的1×PBS重悬细胞后再加入CD71抗体(购自BD公司)5μL，避光保存20 min后离心(1000r/min，5 min)清洗两遍，再使用PBS重悬细胞上流式细胞仪检测。

1.4 小鼠骨髓单个核Ter119+细胞比率检测

用流式细胞术检测小鼠骨髓单个核Ter119+细胞比率。分离出两组小鼠的骨髓单个核细胞分别计数后取出1×106个细胞，加入100μL的1×PBS重悬细胞后再加入Ter119抗体(购自BD公司)5μL，避光保存20 min后离心(1000r/min，5 min)清洗两遍，再使用PBS重悬细胞上流式细胞仪检测。

1.5 小鼠骨髓单个核CD71+细胞的凋亡率检测

用流式细胞术检测小鼠骨髓单个核CD71+细胞比率。分离出两组小鼠的骨髓单个核细胞分别计数后取出 1×106个细胞，用 PBS离心(1000r/min，5min)清洗两遍后，加入CD71抗体(购自BD公司，5μL/mL)，避光保存20 min。然后使用凋亡试剂盒(购自 BD 公司)，加入 FITC－AV(5μL/mL)、PI染液(5μL/mL)，避光保存20 min后，再加入试剂中的结合液(400μL)，样本上流式细胞仪检测。

1.6 小鼠骨髓单个核Ter119+细胞的凋亡率检测

用流式细胞术检测小鼠骨髓单个核Ter119+细胞比率。分离出两组小鼠的骨髓单个核细胞分别计数后取出1×106个细胞，用PBS离心清洗两遍后，加入Ter119抗体(购自BD公司，5μL/mL)，避光保存20 min。然后使用凋亡试剂盒(购自BD公司)，加入 FITC－AV(5μL/mL)、PI染液(5μL/mL)，避光保存20 min后，再加入试剂中的结合液(400μL)，样本上流式细胞仪检测。

1.7 统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件分析。计量资料以珋x±s表示。组间比较采用独立样本t检验。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 低氧组与对照组小鼠血液学分析结果(表1)

表1 低氧组与对照组小鼠血常规分析结果(±s)Table 1 Blood routine analysis of Hypoxia and control group(±s)

表1 低氧组与对照组小鼠血常规分析结果(±s)Table 1 Blood routine analysis of Hypoxia and control group(±s)

分组 n RBC(1012/L) HGB(g/L) HCT(%) WBC(109/L) RET(109/L)低氧组 6 13.32±1.69 218.00±13.93 68.3±1.76 6.36±1.84 151.31±112.85对照组 6 6.78±0.71 155.00±6.57 53.77±2.19 5.60±3.58 293.43±159.88 T 8.764 10.020 12.676 0.431 －1.723 P 0.000 0.000 0.000 0.677 0.120

低氧组与对照组小鼠血液学分析结果显示，低氧组 RBC、HGB、HCT 均明显高于对照组(P＜0.01)。而WBC和 RET(网织红细胞)没有显著性差异(P＞0.05)。

2.2 小鼠骨髓单个核的CD71+细胞比率(图1)

图1 低氧组与对照组小鼠骨髓单核细胞CD71阳性细胞率Figure 1 The ratio of CD71+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

两组小鼠骨髓单个核细胞中的CD71+细胞的流式结果显示，低氧组小鼠模型分离出的骨髓单个核CD71+细胞比率较对照组显著增加(P＜0.05)。说明慢性低氧条件可以促进小鼠骨髓单个核细胞CD71+细胞增殖分化。

2.3 小鼠骨髓单个核细胞Ter119+细胞比率(图2)

图2 低氧组与对照组小鼠骨髓单核细胞Ter119阳性细胞率Figure 2 The ratio of Ter119+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

两组小鼠骨髓单个核细胞中的CD71+细胞的流式结果显示，低氧组小鼠模型骨髓单个核细胞Ter119+细胞比例较对照组显著增加(P＜0.05)。说明慢性低氧条件可以促进小鼠骨髓单个核细胞Ter119+细胞增殖分化。

2.4 小鼠骨髓单个核细胞 CD71+细胞凋亡率(图3)

图3 低氧组与对照组小鼠骨髓单核细胞CD71阳性细胞凋亡率Figure 3 Apoptosis of CD71+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

两组小鼠骨髓单个核CD71+细胞凋亡率流式结果显示，低氧组小鼠骨髓单个核细胞CD71+细胞凋亡率较对照组显著增加且有差异(P＜0.01)。慢性低氧条件下观察到小鼠骨髓单个核细胞CD71+细胞凋亡率增加。

2.5 小鼠骨髓单个核细胞 Ter119+细胞凋亡率(图4)

图4 低氧组与对照组小鼠骨髓单核细胞Ter119阳性细胞凋亡率Figure 4 Apoptosis of Ter119+cells in mouse bone marrow mononuclear cells

两组小鼠骨髓单个核Ter119+细胞凋亡率流式结果显示，低氧组小鼠骨髓单个核细胞Ter119+细胞凋亡率较对照组显著增加且有显著性差异(P＜0.01)。慢性低氧条件下观察到小鼠骨髓单个核细胞CD71+细胞凋亡率增加。

3 讨论

成年人的造血器官主要是骨髓，并且骨髓是一个生理性的氧含量较低的组织，HSC主要留驻在氧供应量有限的壁龛内［9－10］。造血干细胞的自我更新与分化是相对重要的特性，受到胞内与胞外信号的影响调控。据报道［11］，健康成人骨髓穿刺得到平均pO2为54.9±0.98 mmHg，平均 SpO2为87.5%±1.1%。而使用光纤探针检测小鼠的HSC所在的壁龛内的pO2仅为18 mmHg［12］。以上数据提示骨髓局部低氧微环境对HSC的维持以及髓内造血均有重要的调控作用。研究发现［13］，5%低氧浓度模拟骨髓低氧环境培养CD34+HSC能够产生较多的造血干细胞CD34+AC133+HSC，并且观察到造血干细胞的凋亡率明显降低。上述实验证实低氧条件刺激的CD34+HSC有更好的增殖潜力。由于目前缺乏有关低氧刺激对骨髓CD71+、Ter119+细胞作用的相关内容，故本研究提出在慢性低压低氧刺激30天的Balb/c小鼠为模型，观察慢性低氧对其骨髓有核红细胞分化及凋亡的调控作用。本实验血液分析结果提示，慢性低氧条件小鼠模型RBC、HGB、HCT三个指标显著高于对照组(P＜0.01)，符合文献中HAPC动物造模成功的条件。本研究结果显示，流式细胞术结果证实慢性低氧条件下的小鼠骨髓单个核细胞中的CD71+和 Ter119+细胞显著高于对照组(P＜0.05)，说明慢性低氧刺激能够促进小鼠骨髓中的单个核细胞向红系的成熟阶段分化增殖。

有文献报道［14］，小鼠在高海拔地区骨髓中单个核细胞的凋亡率随着时间的延长而增加。本研究结果显示，慢性低氧条件下低氧组小鼠模型骨髓单个核细胞的凋亡率均显著增加，与上述文献报道结果一致。并且本研究观察到小鼠骨髓的有核红细胞向成熟的红系阶段分化，即CD71+、Ter119+细胞凋亡率增高，进一步提示慢性低氧环境可以诱导有核红细胞发生凋亡现象。但孙敏敏等报道［15］，慢性高原病患者骨髓单个核细胞的凋亡率低于健康人群;邹春华等报道［16］，采用HAPC患者骨髓单个核细胞进行体外培养，其凋亡率明显少于正常组。以上结果与本次实验结果不一致，分析原因可能有以下几点:一是本实验采用动物模型与人体有差异;二是本次实验构造的慢性低氧动物模型是参考了文献后设置的海拔高度和低氧时间(低压氧舱模拟海拔5500m，30天)［17］，由于模拟时间较短，小鼠可能尚处于机体抵抗过度红细胞增生的负反馈代偿状态，并未达到高原红细胞增多症的病理状态。