心痛宁加味方对蒽环类药物表柔比星诱导小鼠急性心肌损害的保护作用

王巧琳，段春燕，陆 明，胡 兰，林 燕

（新疆医科大学附属中医医院，乌鲁木齐 830000）

表柔比星是临床上常用的蒽环类化疗药物之一，其主要用于血液肿瘤与实体肿瘤的化疗治疗中，但在临床应用过程中，表柔比星诱导的心脏毒性作用限制其应用剂量，进而影响表柔比星的效果与安全性[1]。相关调查研究显示，心痛宁加味方在临床中具有良好的心肌保护作用，其还可对蒽环类药物诱导心脏功能的损害具有一定保护与遏制作用，但对其实际应用的安全性以及应用剂量仍存在一定的争议[2-3]。本研究探讨心痛宁加味方对表柔比星诱导小鼠急性心肌损害的保护作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取雌性健康SD小鼠60只，平均体质量为（280±25）g，由新疆医科大学动物实验中心提供，合格证编号为SCXK（2014-0004），选取后饲养于25℃、45%湿度的环境中备用。采用随机数字表法将所有小鼠分为6组，分别为对照组、表柔比星模型组、表柔比星联合心痛宁加味方高剂量组、中剂量组、低剂量组、丹参组（表柔比星+丹参），10只/组。

1.2 研究方法 对照组小鼠选择双侧腹腔分别注射生理盐水，5 mL/kg，间隔30 min注射，每隔1日注射1次，7日内共注射4次；模型组则为腹腔内注射表柔比星与生理盐水，表柔比星4.5 mg/kg，每隔1日注射1次，7日内共注射4次，注射表柔比星前30 min选择另一区域向腹腔内注射生理盐水，5 mL/kg；丹参组向腹腔内注射表柔比星与丹参片制备的溶液，表柔比星剂量为5 mL/kg，丹参片剂量为10 mg/kg；其他3组均为注射表柔比星与心痛宁加味方溶液，其中表柔比星剂量为4.5 mg/kg，低剂量组于表柔比星注射前30 min在另一区域内腹腔注射心痛宁加味方溶液，45 mg/kg，中剂量组则为67.5 mg/kg，高剂量组则为90 mg/kg。

1.3 观察指标 末次给药后24 h采血并处死大鼠，采集标本进行检验，BNP、h-FABP 、NO 、SOD活性、cTnI检测试剂盒由奶精建成生物工程研究所提供，Tunel试剂盒由博士德提供，采用速率法测量血浆BNP含量，采用胶乳增强免疫比浊法定量分析cTnI水平，WST-1法测量SOD活性，TBA法测定h-FABP 、NO含量。取小鼠左室心肌应用多聚甲醛固定后进行HE染色，并在光学显微镜下观察心肌组织损伤的形态学变化，并以病例评分法对心肌病变程度进行半定量分析。Tunel法检测小鼠心肌细胞凋亡情况，选择左室心肌应用多聚甲醛进行固定并应用Tunel进行检测，计算凋亡指数为凋亡细胞数占总细胞数的百分率。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行不同分组表达量分析。计量资料以均数±标准差（± s ）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比较 见表1。

2.2 各组小鼠心肌损害病理表现分析 通过对HE染色病理切片观察发现，对照组小鼠心肌切片镜下心肌细胞形态基本正常，部分心肌细胞间隙增宽，可见少量细胞空泡变性及间质少量纤维组织增生；模型组镜下见部分心肌细胞空泡变性，部分细胞间隙增宽，部分细胞溶解、坏死，并见纤维组织增生；高剂量组镜下见部分心肌细胞空泡变性及间隙增宽，部分间质内脂肪、纤维组织增生；中剂量组镜下见部分心肌细胞空泡变性及间隙增宽，少部分心肌细胞溶解、坏死，部分间质可见少量纤维组织增生及少量炎细胞浸润；低剂量组镜下见部分心肌细胞间隙增宽，少量心肌细胞空泡变性，部分间质少量纤维组织增生。

表1 各组大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比较（± s ，n = 10）

表1 各组大鼠血清中BNP、cTnI、h-FABP、SOD及NO含量比较（± s ，n = 10）

注：与空白组比较，# P＜0.05，△P＜0.01

组 别 BNP/（pg/mL） cTn-I/（pg/mL） hFABP/（ng/mL） SOD/（U/mL） NO/（μmol/L）对照组 258.708±72.388 484.781±62.726 1.379±0.088 193.222±25.080 0.432±0.066模型组 543.046±80.607△ 727.432±26.747△ 1.786±0.010# 88.147±8.280# 0.802±0.156#表柔比星+丹参组 313.831±8.911# 550.681±11.619△ 1.406±0.077# 141.035±4.621# 0.602±0.076#表柔比星+高剂量组 289.352±38.281# 579.497±13.274△ 1.432±0.017# 117.529±12.960# 0.551±0.044#表柔比星+中剂量组 372.755±41.583△ 653.275±48.158△ 1.726±0.150# 111.736±26.719# 0.649±0.080#表柔比星+低剂量组 375.469±22.706△ 699.871±12.313△ 1.747±0.143# 90.818±16.053# 0.702±0.043#

2.3 各组大鼠心肌细胞病理评分及凋亡指数情况比较 见表2。

表2 各组大鼠心肌细胞病理评分及凋亡指数情况比较（± s ，n = 10）

表2 各组大鼠心肌细胞病理评分及凋亡指数情况比较（± s ，n = 10）

注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.001，△P＜0.01

组 别 病理评分/分 凋亡指数/%对照组 0 1.52±0.74模型组 2.71±0.25# 66.54±3.82##表柔比星+低剂量组 1.91±0.19# 35.33±1.85△表柔比星+中剂量组 1.70±0.24# 20.59±2.35△表柔比星+高剂量组 1.19±0.21# 16.47±1.62#表柔比星+丹参组 1.20±0.18# 16.52±1.25#

2.4 心痛宁加味方激活PI3K/AKT/mTOR信号通路中蛋白的表达 见图1，图2，图3。

图1 PI3K/AKT/mTOR信号通路中mTOR及其磷酸化和AKT及其磷酸化蛋白表达变化

图2 AKT与mTOR蛋白相对于actin的表达量分析

A.对照组；B.模型组；C.表柔比星+低剂量组；D.表柔比星+中剂量组；E.表柔比星+高剂量组；F.表柔比星+丹参组

图3 p-AKT、p-mTOR分别相对于AKT、mTOR的表达量分析

2.5 心痛宁加味方激活AKT/mTOR信号通路中mRNA的表达 见图4。

图4 心痛宁加味方激活AKT/mTOR信号通路中mRNA的表达

3 讨论

表柔比星等蒽环类药物诱发的心肌损害是其常见的药物不良反应，其心肌损伤机制可能与氧化应激反应、细胞凋亡等密切相关，其中氧自由基所诱发的细胞凋亡是心功能损害的主要机制，试验研究[4-5]显示即使心肌细胞暴露于极低浓度的表柔比星中，同样可导致细胞凋亡的加剧。目前心肌组织活检是评估蒽环类药物心脏损害的金标准[6]，而在动物实验中通过表柔比星的心肌损害，可见其心腔的明显增大以及心室壁变薄，并有一定的风险诱发心包积液、扩张型心肌病等，随着病情的加重可出现细胞间隙明显增宽、炎症细胞浸润等现象[7-8]。

本研究结果表明，各组BNP、h-FABP 、NO、SOD活性、cTnI指标比较存在显著差异，模型组心肌细胞病例评分明显高于低、中、高剂量组，并且各组心肌细胞凋亡指数比较存在显著差异，以模型组心肌损害、凋亡效果最为严重，除对照组外以高剂量组心肌损害、凋亡最轻。心痛宁加味方是沈宝藩教授根据“痰瘀同治”的治疗原则，在心痛宁方基础上配伍新疆民族药中化痰通络之品组方。沈宝藩教授认为，肿瘤病虽为本虚标实之证，但痰湿凝聚是导致其发生的重要方面，在肿瘤的形成过程中，痰湿乃因血瘀导致津液运行失常而成，一旦形成则痰瘀互结，日久成积，从而形成了血瘀津停，痰瘀互结的肿瘤病机的基础[9-10]。方中瓜蒌、薤白利气化痰，散结宽胸，温阳止痛；佐以当归、丹参、红花、川芎活血化瘀，行气止痛；配合以厚朴、桔梗苦降辛开，行气散结[11]；伍以新疆民族药新塔花、阿里红、沙棘、豆蔻，气血双调。诸药配合，瘀祛痰消，脉络通畅，疼痛得解。通过进一步回顾分析认为，丹参作为唇形科多年生草本植物在药典中具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，成分中主要有脂溶性的多种丹参酮类及水溶性的原儿茶酚醛和儿茶酚的衍生物[12-14]，具有扩张冠脉、增加血流量、耐缺氧、增强心肌收缩力、减慢心率的功效，从而促进组织修复，改善心脏功能，应用于小鼠中同样可遏制蒽环类药物心脏损害进程，为小鼠心肌提供保护作用[15]。

综上所述，心痛宁加味方对表柔比星诱导的小鼠心肌损害具有良好的保护作用，可有效降低氧自由基的产生，并通过降低脂质过氧化物含量达到改善心肌损害及调节凋亡的目的。但本研究仍存在一定的缺点与不足，如样本容量过小可能导致结果客观性不足，这有待于进一步临床研究证实。