川芎嗪联合紫衫醇对HL-60细胞凋亡的影响

李续博，姜广宇，董 航*

（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002）

急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种恶性血液肿瘤[1-2]，急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓细胞白血病（AML）的一种亚型，以其独特的染色体异常，即t（15；17）产生融合基因PML-RARα及其编码的蛋白为主要特征[3-5]。使用全反式维甲酸（ATRA）、三氧化二砷（ATO）、化疗药物，或与化疗药物兼用是治疗APL的主要策略[6]。虽然有可能在低风险的APL治疗中获得成功，但对高危APL治疗成功案例尚未见报道。因此，需要开发治疗高风险APL的治疗药物。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，是从伞形科藁本属植物川芎中分离提纯的生物碱单体，是中药川芎的主要有效成分。近年来研究发现，川芎嗪能有效抑制肿瘤细胞的侵袭及转移，促进肿瘤细胞凋亡的作用。紫杉醇是一种微管稳定剂，用作治疗卵巢癌、乳腺癌和肺癌，肉瘤、淋巴瘤和白血病的化疗药物[8]。紫杉醇因其具有很高的协同作用，所以常与其他药物联合使用，可以克服单独使用时产生的耐药性[9]。所以本研究川芎嗪与紫杉醇联用对急性早幼粒细胞的影响，探索治疗急性早幼粒细胞白血病的新策略。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 HL-60细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司），紫衫醇（赫澎生物上海科技有限公司20170321），川芎嗪（赫澎生物上海科技有限公司20170925）。川芎嗪和紫衫醇在DMSO中溶解并在浓缩的蒸馏水中进行浓缩至10 mM和1 M，过滤。

1.2 细胞培养 在这项研究中我们使用HL-60细胞系作为人类急性早幼粒细胞白血病模型。HL-60细胞在含有1%的谷氨酰胺，1%青霉素/链霉素，10%热灭活胎牛血清（FBS）RPMI-1640培养基中培养，在标准细胞培养箱中保持37 ℃，5%二氧化碳和95%相对湿度。

1.3 细胞毒性试验 紫杉醇和川芎嗪对HL-60细胞的毒性作用使用细胞增殖剂WST-1（罗氏）测定。细胞接种于96孔板，细胞浓度106个/mL。实验细胞取处于对数生长期，川芎嗪（10 μM～1 nM）和紫杉醇（10 mM～1 μM）处理细胞24 h，48 h，72 h。未经处理的细胞作为对照组。活细胞形成的形成甲瓒染料使用酶标仪波长450 nm和620 nm检测。

1.4 细胞凋亡测定 紫杉醇与川芎嗪联合用药对HL-60细胞凋亡的影响，使用AnnexinV EGFP细胞凋亡试剂盒和JC-1分析试剂盒。HL-60细胞1×106个/mL接种于6孔板中，紫杉醇与川芎嗪联合用药（4 μM川芎嗪和34 nM紫杉醇）处理细胞24 h、48 h 和72 h。结果通过对荧光显微镜Olympus BX51对200个细胞进行计数处理。

1.5 实时定量 PCR分析 测定mRNA表达的变化，联合药物处理细胞48 h内联合剂量（4 μM川芎嗪和34 nM紫杉醇）。用高纯度RNA分离试剂盒提取总RNA。联合药物处理和未经药物处理的细胞进行细胞周期、凋亡与若干信号通路相关基因cDNA合成。基因的表达是通过LightCycler 480实时荧光定量RT-PCR研究仪器II检测 ，2-△△CT法定量比较样本对内参的循环阈值的差异。

1.6 统计学分析 IC50值和川芎嗪联合紫衫醇对HL-60细胞剂量使用Calcusyn 2软件进行非线性回归曲线计算。real-time RTPCR变化使用在线软件统计分析，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞毒性 IC50剂量，紫杉醇和川芎嗪72 h剂量分别为4.8 nM（R2= 0.896 1，P＜0.05）和398.7 m（R2=0.948 3，P＜0.05）（图1、2），紫杉醇与川芎嗪最佳联合剂量为34 nM和4 μM（R2= 0.975 74，P＜0.05）（图3、4）。

2.2 川芎嗪联合紫杉醇对细胞凋亡的影响 紫杉醇和川芎嗪对HL-60细胞凋亡的影响，Annexin V法，与对照组相比，联合用药 24 h，48 h，72 h分别为对照组的1.14倍，12.7倍，8.2倍（图5）。JC-1法，与对照组相比，24 h，48 h和72 h，联合剂量组细胞凋亡分别为对照组的2.5倍，9.4倍，114.3倍（图6）。

图1 紫杉醇对HL-60细胞的影响

图3 川芎嗪联合紫杉醇对HL-60细胞的影响

图4 川芎嗪联合紫杉醇对HL-60细胞的影响

图5 紫杉醇对HL-60细胞凋亡的影响

2.3 川芎嗪联合紫杉醇对基因表达的影响 紫杉醇和川芎嗪的组合对HL-60细胞中24个基因的表达发生了显著的变化（P＜0.05）。其中22个基因表达下调，2个基因表达上降。见表1。

3 讨论

APL是AML的一种亚型，临床早期由于弥散性血管内凝血（DIC）引起出血致死率非常高，使用全反式维甲酸降解PML/RARα融合蛋白，ATO或与化疗药物联合应用是APL的主要治疗策略[7]。虽然对低危患者的治疗可以通过全反维甲酸- ATO联合治疗可以治愈，但对于高风险APL的治疗成功案例尚未有报道。因此，开发治疗高危APL药物是目前的迫切需要。

图6 川芎嗪对HL-60细胞凋亡的影响

紫杉醇是一种微管稳定剂，用作治疗卵巢癌、乳腺癌和肺癌，肉瘤、淋巴瘤和白血病的化疗药物[8]。紫杉醇因其具有很高的协同作用，所以常与其他药物联合使用，可以克服单独使用时产生的耐药性[9]。在临床前细胞实验研究表明：紫杉醇与ATRA联合用药具有诱导急性髓白血病的协同作用[10]。单独紫杉醇诱导HL-60细胞凋亡，0.1 μm和1 μm 24 h内诱导HL-60细胞凋亡分别为17.8倍和 16.5倍[11]。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，是从伞形科藁本属植物川芎中分离提纯的生物碱单体，是中药川芎的主要有效成分。近年来研究发现，川芎嗪能有效抑制肿瘤细胞的侵袭及转移，促进肿瘤细胞凋亡，这对白血病的髓外转移和复发具有积极的意义[12-15]。

细胞增殖与分化与正常造血系统密切相关。在细胞分裂过程中，两个细胞中的一个维持干细胞的特性，另一种则维持干细胞的特性。单核细胞和淋巴细胞的细胞系获得的需求增加[16]。增生增加白血病的遗传损伤的概率，损伤的DNA反应通路有助于遗传变异，导致白血病的加速形成[17]。因此，细胞周期调控因子如细胞周期调节改变，细胞周期蛋白依赖激酶（CDK），控制点和有丝分裂激酶激酶导致不规则增生与分化的相互作用髓系恶性肿瘤的途径。例如，CCND2频繁表达高水平的B细胞恶性肿瘤如BLL，LPL[18]。此外，CDK6，具有造血功能的独特作用，主要表达于造血细胞类型。这个小鼠胸腺萎缩和CDK6损失导致红血减少细胞，粒细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和血小板，以及因为在CDK6小鼠淋巴细胞G1晚期进展[19-21]。

表1 川芎嗪联合紫杉醇对基因表达的影响

在这项研究中，紫杉醇联合川芎嗪促进HL-60细胞细胞周期蛋白（CCNB1，CCNB2，CCNC，CCND1，CCND2，CCNE1，CCNF，CCNG1、CCNG2）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDC16、CDC20，CDC25A，CDC34、CDK1、CDK2、CDK4 、CDK5R1、CDK7，CDK8）表达下降。此外，细胞周期蛋白依赖性抑制激酶CDKN1B表达增加，DNA损伤应答基因ATR 、CHEK1、CHEK2和细胞周期相关因子E2F4表达量降低。

在我们的研究中，川芎嗪在低剂量下具有协同作用。4 μM川芎嗪与34 nM紫杉醇联合用药诱导HL-60细胞凋亡。因此，我们建议将紫杉醇和川芎嗪两者结合起来的方法作为开发治疗APL的一种新的治疗策略。