植物蛋白的研究进展

高蕾蕾,李迎秋

(齐鲁工业大学 食品科学与工程学院,山东 济南 250353)

蛋白质可被定义为由多种氨基酸通过肽键彼此连接的具有一定空间结构的生物大分子,包含C、H、O、N,通常还含有P、S等元素,是所有细胞原生质的主要组成,广泛存在于动物与植物体内,为生命所必需[1]。蛋白质体现着机体的生命现象,深入研究蛋白质的结构和功能,将有助于阐明生命的本质。

1 植物蛋白的概况

蛋白质按照食物来源，可分为动物性蛋白质和植物性蛋白质。动物性蛋白质的来源主要是肉、蛋、奶及鱼虾等,且大多属于优质蛋白质,包含人体必需的各种氨基酸,营养价值较高。但是,动物性食品摄取的比重过大会导致一系列健康问题,诸如高血压、心脏病、肥胖症等[2]。另外,世界人口的增长和蛋白质资源的不足,同样也促使人们去寻求替代动物蛋白的优质蛋白质资源——植物蛋白。植物蛋白来源广泛,营养与动物蛋白类似,但更易被人体消化吸收[3]。此外,植物蛋白具有多种生理保健功能,如降低胆固醇、抗氧化和降血压等,因此植物蛋白的研究开发变得尤为重要[4]。

李帅斐[5]利用碱法提取和酶法改性的方法得到米糠蛋白,并对米糠蛋白的功能和抗氧化性质进行了研究，且将其应用到面包生产中。结果表明，添加了米糠蛋白的面包不仅品质得到改善,而且营养价值提高、货架期延长。郑亚军[6]从植物蛋白资源丰富的油棕粕中分离筛选出具有降血压作用的蛋白质,采用超高压辅助复合酶解技术制备降血压肽。结果表明，降血压肽具有缓解细胞氧化压力、减少细胞氧化损伤、降低血压的作用。

2 植物蛋白的提取

利用植物蛋白的差别将目的蛋白与非蛋白质杂质和非目的蛋白相互分离,最常见的方法有碱溶酸沉法、酶提取法、有机溶剂提取法、盐溶提取法、反胶束萃取法等。

2.1 碱溶酸沉法

碱溶酸沉法是最常用的植物蛋白提取方法,利用的原理是植物蛋白易溶于碱性环境,在酸性等电点条件下析出。碱溶酸沉法的优点是蛋白质的提取率和纯度都较高,易操作，成本低；缺点是过高浓度的碱液会使提取出的蛋白质发生美拉德反应,影响蛋白质的营养特性[7]。袁诗涵等[8]以陕北主产的黄米为原料,利用碱溶酸沉法提取黄米蛋白,通过正交试验优化得出黄米蛋白的最佳提取率为86.93%。徐江波等[9]以亚麻籽为原料,采用碱溶酸沉法提取亚麻籽蛋白,在单因素实验和响应面优化的基础上,得出亚麻籽蛋白的最佳提取率为79.26%,纯度高达92.34%。

2.2 酶提取法

采用酶法提取植物蛋白的优点是效率高，反应条件温和,操作安全,不会产生有害物质；缺点是对操作环境要求较为严格,相比碱法提取蛋白,需要增加灭酶的步骤[10]。谭萍等[11]研究了酸性蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶对苦荞麦蛋白质的提取效果,结果表明，碱性蛋白酶对苦荞麦蛋白质的提取效果最好。

2.3 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法主要针对不溶于水、酸液、碱液和稀盐溶液的蛋白质,因为这类蛋白质和脂质结合牢固,只溶解于乙醇、丙酮等亲脂性较强的有机溶剂,且必须在低温下进行操作以防止蛋白质变性[12]。姜福佳等[13]利用乙醇浸提法提取啤酒糟中的醇溶蛋白,在单因素实验和响应面优化的基础上,确定啤酒糟醇溶蛋白的最佳提取条件为乙醇浓度81%、固液比1∶21(g/mL)、提取温度48 ℃、提取时间50 min,在此条件下，醇溶蛋白的提取率为7.8%。

2.4 盐溶提取法

盐溶可被定义为少量的中性盐如硫酸铵会使蛋白质分子表面的电荷增加,促进蛋白质分子与水分子相互作用,进而增大蛋白质分子在水溶液中溶解度的现象。盐溶法的优点是维持了蛋白质的天然构象,不易变性,但提取率和纯度都较低。白正晨等[14]以蚕豆粉为原料,加入2.5%的NaCl溶液,经磁力搅拌、冷冻离心之后获得的上清液即为蚕豆盐溶蛋白。

2.5 反胶束萃取法

反胶束萃取技术是一种用于蛋白质提取的新型技术[15]。反胶束是指表面活性剂分子的亲水端朝里、疏水端朝外，形成具有增溶蛋白质能力的“水池”,其实质是具有热力学稳定性和光学透明性的纳米尺度的聚集体。刘海远[16]主要研究了AOT、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)三种反胶束体系萃取大豆蛋白的最佳工艺条件、影响因素和动力学过程,并与碱溶酸沉法提取的大豆蛋白进行比较,结果表明，利用反胶束萃取的大豆蛋白的功能特性更有优势,且反胶束萃取技术对大豆蛋白的结构特性影响较小,具有一定的保护作用。

2.6 其他提取技术

上述提及的是比较常见的蛋白质提取技术,其他的提取技术主要是辅助提取法和复合提取法,目的是增加蛋白质的提取率。杨希娟等[17]利用超声波辅助法提取青稞蛋白,通过正交试验确定青稞蛋白的最优提取工艺条件为pH10.5,料液比1∶22(g/mL),超声功率550 W,提取时间20 min,在此条件下，青稞蛋白的最佳提取率为93.15%,纯度为78.67%。超声波辅助法提取的青稞蛋白的功能特性较好,可以应用在肉制品、烘焙食品中。马谦等[18]以玉米黄粉为原料,利用微波辅助法提取玉米醇溶蛋白,通过正交试验，得出在乙醇浓度80%、料液比1∶14(g/mL)、颗粒度20目、微波功率420 W、处理时间360 s的条件下,玉米醇溶蛋白的提取率为25.73%,并且可以很好地应用于鸡蛋涂膜保鲜工艺中。

3 植物蛋白的分离纯化

3.1 利用蛋白质溶解度的差异

不同的蛋白质具有不同的溶解度,蛋白质分子在水中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水化层厚度和带电荷数量[19]。不同的蛋白质分子,由于其分子表面极性基团的种类、数量以及排布不同,其水化层的厚度和带电荷数量也不同,从而造成蛋白质的溶解度不同。此外,外界环境因素如溶液的pH值、离子强度、温度以及介电常数等都可以影响蛋白质的溶解度。因此,适当改变外界因素可以降低蛋白质混合溶液中蛋白质的溶解度,提高分离效果。

3.1.1 盐析法

盐析法是向蛋白质溶液中加入高浓度中性盐,盐离子与水分子的相互作用可以使水分子的活度和蛋白质的水合程度降低,最终导致蛋白质的溶解度降低,形成沉淀析出的过程。常用的盐析剂是硫酸铵,因为其盐析能力强，浓度高时也不会使蛋白质的生物活性丧失。盐析法的优点是操作简便,能除去较多的杂质蛋白,可以保护易变性的蛋白质,有一定的浓缩作用；缺点是分辨能力差,纯化倍数不高,需要透析除盐。陈秀清等[20]比较了利用酸加热法、碱加热法、盐析法和有机溶剂法提取南美蟛蜞菊叶蛋白的效果,结果发现，盐析法是提取南美蟛蜞菊叶蛋白的最适方法，蛋白质提取率高,且活性较好。

3.1.2 等电点沉淀法

等电点沉淀法的原理:蛋白质是两性电解质,其溶解度与净电荷数量相关,当溶液的pH值等于蛋白质等电点时,蛋白质的溶解度最低，形成沉淀。不同的蛋白质有不同的等电点,利用蛋白质等电点的差异,调节溶液的pH值等于目的蛋白的等电点,使目的蛋白沉淀,通过离心可以得到所需要的目的蛋白。朱秀灵等[21]利用等电点沉淀法制备芝麻蛋白,并与超滤法制备的芝麻蛋白进行比较,结果表明，等电点沉淀法制备的芝麻蛋白的泡沫稳定性优于超滤法制备的芝麻蛋白。

3.1.3 有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀法的原理：一方面，极性有机溶剂可以降低水的介电常数，使蛋白质分子的水化程度降低,促进蛋白质分子的聚集沉淀；另一方面，极性有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层,使蛋白质分子发生沉淀。乙醇、丙酮是两种最常用的有机溶剂,且须在低温下使用。

3.2 利用蛋白质分子的大小差异

蛋白质是大分子物质,可以考虑用透析法、超滤法等将小分子物质除去,还可以用凝胶过滤层析法根据蛋白质分子量将目的蛋白与杂质蛋白分离。

3.2.1 透析法

透析法是利用半透膜的截留作用,蛋白质大分子不能通过半透膜而小分子杂质可以通过半透膜,从而使蛋白质与小分子杂质分开的方法。将蛋白质溶液装在具有一定截留分子量半透膜的透析袋中,置于蒸馏水中透析,为了缩短透析时间,可以经常换水,一定时间后小分子杂质通过半透膜而除去,目的蛋白仍留在透析袋中保存下来。

3.2.2 超滤法

超滤法主要是根据超滤膜的孔径大小分离纯化目的蛋白,即比超滤膜孔径大的蛋白质分子被截留而保存下来,比超滤膜孔径小的杂质分子则不被截留而除去。杨国龙等[22]利用超滤法生产大豆浓缩蛋白,主要是通过平板聚醚砜超滤膜除去大豆浓缩蛋白生产过程中的可溶性多糖等小分子杂质,从而得到蛋白质含量大于72%的大豆浓缩蛋白。

3.2.3 凝胶过滤层析法

凝胶过滤层析[23]也称分子筛层析、分子排阻层析,是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。当大小不同的蛋白质分子混合物流经凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的蛋白质分子不能进入网孔,而是随着缓冲液在网孔外侧向下移动,并最先流到柱外;比凝胶网孔小的蛋白质分子可以顺利进入网孔,并根据蛋白质分子量进出不同孔径的网孔,然后随着缓冲液流到柱外。较大分子量的蛋白质分子移动的路程短,最先流出,较小分子量的蛋白质分子移动的路程长,最后流出,从而使不同分子量的蛋白质得以分离纯化。邹存媛等[24]利用中性蛋白酶酶解大豆蛋白，通过正交试验确定大豆蛋白肽的最优提取条件,并采用凝胶过滤色谱法分离收集分子量小于1200 Da的小肽。

3.3 利用蛋白质分子的电荷差异

蛋白质分子含有羧基、氨基等可解离的基团,由于不同蛋白质分子的结构不同,其电离基团的组成及在分子表面的暴露情况不同,因此不同蛋白质分子所带电荷的性质及净电荷量也不同。根据蛋白质分子的电荷差异,可采用电泳法和离子交换层析法进行分离纯化。

3.3.1 电泳法

在一定pH值的溶液中,蛋白质分子可以解离成带正电荷和负电荷的分子,在直流电场中,带正电荷的分子向负极移动,带负电荷的分子向正极移动。不同的蛋白质分子由于净电荷量和分子量大小不同,在相同条件下电泳时,电泳速度各不相同,从而彼此分开。常见的电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、等电聚焦电泳等。Magdalena Montowska等[25]为了寻找六种肉类蛋白质的区别以及获得具有耐热稳定性和高品质的肉类蛋白,利用双向电泳分析原料肉的蛋白质表达谱图,结果表明，双向电泳可以识别调节蛋白、代谢酶、某些肌原纤维蛋白和血浆蛋白的特定蛋白质,并以此观察不同原料肉的蛋白质结构,将其中的不同点作为肉类产品的标志。

3.3.2 离子交换层析法

离子交换层析是根据电荷差异来分离带电离子不同的蛋白质、多肽、氨基酸等带电分子的技术。当溶液的pH值大于蛋白质的等电点时,蛋白质分子带负电,可结合于阴离子的交换剂上;当溶液的pH值小于蛋白质的等电点时,蛋白质分子带正电,可结合于阳离子的交换剂上。邓雪等[26]利用硫酸铵沉淀和DEAE琼脂糖快速离子交换层析法提取纯化茶花水溶性蛋白,通过体外吸附胆酸盐能力的测定得出茶花水溶性蛋白具有一定的降血脂保健功能。

3.4 利用蛋白质分子的吸附能力差异

吸附层析法是利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异对目标物进行分离。一般来说,蛋白质对非极性吸附剂如活性炭的吸附主要靠范德华力和疏水作用,对极性吸附剂的吸附主要靠离子键和氢键[27]。其中的疏水吸附层析技术已经广泛应用于蛋白质及其生物大分子的分离与纯化。姚善泾等[28]研究了一种新型生物分离方法,即混合模式吸附层析技术,主要为静电和疏水相互作用,结果表明，在低盐和高盐的条件下均能实现对目标物的分离,且分离效率提高,具有一定的应用价值。

4 植物蛋白的功能特性

蛋白质对食品的感官品质具有重要的影响,主要是对食品成分在加工、储藏过程中物理特性的影响。一般来说,决定蛋白质功能特性的物理、化学性质包括蛋白质的结构、大小、形状、氨基酸组成、净电荷分布、疏水基团与亲水基团的比例、蛋白质分子间的作用力等[29],但是很难描述食品的功能特性与哪种特定蛋白质的理化特性相关。食品的感官品质特性是通过各种功能配料之间复杂的相互作用获得的。根据蛋白质所能发挥的作用特点,可以将蛋白质的功能特性分为三类:蛋白质与水相互作用,如分散性、溶解性、黏度、持水力等;蛋白质与蛋白质相互作用,如沉淀、胶凝作用等;蛋白质界面性质,如乳化性、起泡性、持油性等[30]。蛋白质在食品体系中的功能特性见表1。

表1 蛋白质在食品体系中的功能特性

5 蛋白质水解产物的生理作用

蛋白质经酸法、碱法或酶法水解得到的多为多肽、氨基酸等小分子混合物的水解产物,其主要作用是提高产品的营养价值、改善产品品质、获得较好的功能特性等。

5.1 抗氧化多肽

人体自身或外界刺激都会在机体内产生自由基,从而促使人体衰老甚至威胁人类的健康。目前在食品行业中常使用合成的抗氧化剂清除自由基,虽然效果好,但是存在一定的不安全性。抗氧化多肽具有较强的抗氧化活性,通常强于蛋白质本身。生物体内的天然抗氧化肽主要是肌肽和谷胱甘肽,但含量很少[31]。陈思远等[32]用胰蛋白酶酶解小麦胚芽清蛋白,以DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力为抗氧化活性指标,结果发现，小麦胚芽清蛋白酶解产物具有抗氧化活性。

5.2 抗菌多肽

抗菌多肽是自然界中普遍存在的具有特殊生物活性的肽类,可以抗细菌、真菌和病毒等,常作为天然的食品防腐剂用于食品工业中。多肽的抗菌机制[33]主要作用于细胞膜,改变其通透性,打破原有的平衡,使细胞内容物渗漏,从而导致细菌的死亡。赵国萍等[34]利用流式细胞仪和圆二色谱技术研究大豆碱性多肽对大肠杆菌的抑制机理,结果表明，大豆碱性多肽会导致大肠杆菌细胞膜皱缩,严重破坏细胞膜的完整性，同时还会损害细胞的DNA,这说明大豆碱性多肽是一种具有较强抗菌活性的物质,可以应用在食品工业中。

5.3 降血压肽

降血压肽又称为血管紧张素转化酶抑制肽,是一类具有显著降低血压功效的短链多肽物质。血管紧张素转化酶是一类与血压息息相关的酶类,其作用机理是:血管紧张素转化酶可以将血管紧张素Ⅰ转化为具有很强活性的血管收缩剂血管紧张素Ⅱ,从而导致血压升高,因此抑制血管紧张素转化酶就可以很好地控制血压[35]。王茵等[36]将制备好的紫菜降血压肽应用于大鼠体内并与降压药物卡托普利作对比,结果发现，紫菜降血压肽对高血压大鼠具有降血压的效果,长期服用无毒副作用,而降压药卡托普利虽然降血压的效果优于紫菜降血压肽,但会导致正常大鼠的血压降低。

5.4 免疫活性肽

免疫活性肽通过提升巨噬细胞的吞噬功能和淋巴细胞的增殖能力等来增强机体的免疫力,从而降低自身疾病的发生率。王鹏等[37]通过超滤、凝胶色谱及反相高效液相色谱技术纯化榛仁分离蛋白水解肽,并对纯化的水解肽进行测定,结果表明，榛仁分离蛋白水解肽不仅对细胞无毒性作用,而且可以提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力,具有较好的免疫调节作用。

随着社会的不断进步,人们对食品及保健品的要求越来越高。植物蛋白来源广泛,成本低廉,却拥有与动物蛋白相类似的营养组成,所以开发和利用植物蛋白资源显得尤为重要,也是今后研究开发的热点。