南瓜类胡萝卜素的提取及果实发育中的含量变化

徐小军，李 可，张桂兰

(1.中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009； 2.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 广东湛江 524091)

南瓜(CucurbitaL.)属于葫芦科一年生草本植物，拥有丰富的营养物质含量和良好的食疗保健作用，在世界范围内广泛种植。南瓜含有20余种营养成分，特别是类胡萝卜素、多糖、果胶、葫芦巴碱等，可作为天然保健营养成分，已成为近年来研究热点[1-2]。南瓜中含有丰富的类胡萝卜素，绝大多数品种中以β-胡萝卜素为主[3]。南瓜果肉中的类胡萝卜素含量(鲜质量)高达 40.5 mg·100 g-1，其中 β-胡萝卜素含量为24.4 mg·100 g-1[4]。类胡萝卜素是一种有效的单线态氧淬灭器，具有解链抗氧化作用，保护细胞和其他身体成分免受自由基攻击，提高人体免疫力，降低早衰、癌症、动脉粥样硬化、白内障、老年性黄斑变性和一系列退化性疾病的发生率。β-胡萝卜素具有良好的维生素A原的活性，维生素A对上皮细胞的正常生长与分化、维持正常视觉、促进骨骼发育具有重要的生理作用，食用β-胡萝卜素含量较高的食品不仅可以防止缺乏维生素A引起的各种疾病，还能降低心脏病、癌症等疾病的发病率。把优质南瓜作为质优、价廉的胡萝卜素来源具有重要意义。

目前关于南瓜果肉类胡萝卜素含量的研究，主要是关于不同中国南瓜(Cucurbita moschata)、印度南瓜(C.maxima)、美洲南瓜(C.pepo)栽培种中类胡萝卜素含量和种类差异，或是不同品种成熟期类胡萝卜素含量差异的研究，而关于不同品种不同发育时期类胡萝卜素积累规律的研究还未见报道[3,5-8]，并且关于南瓜果肉类胡萝卜素的最佳提取工艺也不尽相同[9-10]。因此，笔者选取了国内市场上比较畅销的5个不同类型的南瓜品种，拟通过单因素和正交试验筛选出南瓜果肉类胡萝卜素的最佳提取工艺，并通过测定果实不同发育时期类胡萝卜素含量，来推测不同南瓜品种中类胡萝卜素的积累与变化规律，为南瓜类胡萝卜素提取和品质育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为5个不同的南瓜商品种(A:‘迷你荃鑫’；B:‘绿圆’；C:‘荃鑫6号’；D:‘黑晶’；E:‘早丰蜜’)，除了‘早丰蜜’属于中国南瓜外，其余4个均为印度南瓜。材料于2016年3月种植于中牟县设施大棚内，采用吊蔓种植，3蔓整枝，株行距0.6 m×2.0 m，采用随机区组试验设计，3次重复，每个重复4行，每行15株，开花期人工授粉，常规肥水管理。分别于授粉后 7、14、21、28、35、42、49、56 d 取样，南瓜果实去皮、去籽，保留果肉，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存备用，后续试验在中国农业科学院郑州果树研究所生物技术实验室进行。

1.2 方法

1.2.1 最佳提取溶剂的筛选 分别以无水乙醇、甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、V丙酮∶V石油醚=1∶1、V丙酮∶V石油醚=1∶2、V丙酮∶V石油醚=2∶1(后同)的试剂为提取溶剂，以品种C‘荃鑫6号’花后56 d的样品为试验材料，称取0.5 g样品，加入5 mL溶剂，避光浸提30 min，12 000 r·min-1离心 10 min，吸取上清液至25 mL容量瓶中，沉淀中再次加5 mL浸提剂，重复上述操作，直至样品呈白色。用浸提溶剂定容，利用紫外分光光度计测定提取液在450 nm处的吸光值。

1.2.2 最佳处理方法筛选 分别以超声波和微波处理为辅助手段提取南瓜果肉中的类胡萝卜素，以

1.2.1中筛选到的无水乙醇为提取溶剂，试验共设3个处理。

1.2.3 正交试验设计 在单因素试验的基础上选择处理时间、料液比、抽提次数为考察因素，以类胡萝卜素提取率为考察指标，进行3因素3水平正交试验设计，参照L9(34)正交表(表1)安排试验，筛选南瓜果肉类胡萝卜素提取的最佳条件。

表1 正交试验的因素与水平

1.2.4 南瓜果肉类胡萝卜素的提取 用万能高速粉碎机加液氮将南瓜果肉粉碎成粉末状，称取0.5 g样品，加入2 mL浸提剂，避光超声浸提8 min，12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液至25 mL容量瓶中，沉淀中再次加入2 mL浸提剂，重复上述操作，共抽提4次，直至样品呈白色。用浸提剂定容，备用。利用紫外分光光度计测定样品450 nm处的吸光值。

1.2.5 标准曲线的绘制 用分析天平准确称取2 mg的β-胡萝卜素标准品，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，制成β-胡萝卜素标准液。移液枪分别取0.2、0.4、2、4、6、8、10 mL 标准液，用无水乙醇定容至10 mL，于450 nm处测吸光值，绘制标准曲线。

1.2.6 类胡萝卜素提取率计算 类胡萝卜素提取率计算公式为:X=[(C×V)/W]×100。式中，X为类胡萝卜素提取率(mg·100 g-1)；C为标准曲线上对应的类胡萝卜素质量浓度(mg·mL-1)；V为浸提溶液最终定容体积(mL)；W为称量的南瓜果肉鲜质量(g)。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素标准曲线

利用β-胡萝卜素标准品绘制标准曲线。由图1可知，样品浓度与吸光值OD450呈高度线性相关，线性方程为Y=64.253X+0.047 4(R2=0.999 2)。因此，试验中可根据此线性方程进行类胡萝卜素含量的计算。

2.2 南瓜果肉类胡萝卜素最佳提取剂的确定

选取8种已报道的用于类胡萝卜素提取最多的溶剂，提取‘荃鑫6号’南瓜果肉中类胡萝卜素，然后测定提取液在450 nm处的吸光值。由图2可知，这8种提取剂在同一条件下，无水乙醇的提取率显著高于其他几种溶剂，石油醚提取率最低，显著低于其他7种提取溶剂，剩下6种溶剂提取效果无显著差异。

2.3 南瓜果肉类胡萝卜素提取最佳处理方法的确定

由于类胡萝卜素常温下不稳定，因此为防止类胡萝卜素降解，提取过程应尽可能缩短提取时间。笔者尝试利用超声波和微波处理来辅助类胡萝卜素的提取。参考2.2的试验结果，选用无水乙醇作为提取溶剂，采用超声波辅助法和微波加热辅助手段来提取类胡萝卜素，并以静置提取法为对照。由图3结果可以看出，用超声波辅助法可显著提高类胡萝卜素提取率，且超声波辅助的提取效果好于微波。另外，利用超声波处理可以提高工作效率。因此初步确定南瓜果肉类胡萝卜素提取的最佳方法为超声波辅助法。

2.4 正交试验结果

在前面试验基础上，选取提取过程中的3个主要影响因子:料液比、浸提时间和抽提次数设计了正交试验，进一步确定南瓜果肉提取类胡萝卜素的最优条件。由表2试验结果可知，3个因子对类胡萝卜素提取效果的影响次序为:抽提次数>料液比>处理时间。其中抽提次数对类胡萝卜素提取率影响最大，而处理时间影响最小，由此可见，在超声波辅助条件下，样品中的类胡萝卜素可以快速被浸提出来。由表2的结果可以看出，处理时间为8 min和12 min时，类胡萝卜素提取率相近，都明显高于处理时间为4 min时的提取率。随着溶剂量的增加，提取率呈下降趋势。因此，南瓜果肉类胡萝卜素提取的最佳条件为:超声波辅助下，料液比1∶4，浸提8 min，共抽提4次。

表2 南瓜果肉类胡萝卜素提取的正交试验组合及结果

2.5 5个南瓜品种果实发育过程中类胡萝卜素含量的变化

由图4可以看出，5个南瓜品种类胡萝卜素积累的整体趋势一致，随着成熟度增加，果肉中类胡萝卜素含量均逐渐增加。但每个品种的类胡萝卜素积累规律各不相同。花后7～14 d，5个南瓜品种类胡萝卜素含量均较低，无显著增加；14 d后，‘迷你荃鑫’‘荃鑫6号’类胡萝卜素含量开始显著增加，而‘绿圆’‘黑晶’‘早丰蜜’类胡萝卜素含量则从28 d后才开始显著增加。花后28 d各品种类胡萝卜素含量均进入快速增长期。其中‘荃鑫6号’‘绿圆’和‘黑晶’在花后49 d类胡萝卜素的积累趋于稳定，果肉中类胡萝卜素含量无显著增加。‘迷你荃鑫’和‘早丰蜜’则直到花后56 d仍在显著增加。5个品种中类胡萝卜素含量较高的2个品种‘迷你荃鑫’和‘黑晶’在早期(7～14 d)含量无显著差异，从21 d开始‘迷你荃鑫’的类胡萝卜素含量极显著高于其他品种。成熟期5个品种类胡萝卜素含量依次为:‘迷你荃鑫’>‘黑晶’>‘荃鑫6号’>‘绿圆’>‘早丰蜜’。不同品种间，南瓜果肉中类胡萝卜素含量差异明显。研究结果表明，不同南瓜品种中类胡萝卜素的积累规律存在差异，5个品种南瓜果肉类胡萝卜素含量在花后28～49 d均显著增加，因此推测，花后28～49 d可能是大多数南瓜品种类胡萝卜素合成与积累的关键时期。测定的4个印度南瓜品种类胡萝卜素含量均高于中国南瓜。

图4 不同南瓜品种在不同发育时期类胡萝卜素含量的变化

3 讨论与结论

目前关于南瓜果肉类胡萝卜素含量的研究，主要是关于不同栽培种(中国南瓜、印度南瓜、美洲南瓜)中类胡萝卜素含量和种类的差异，或是不同品种成熟期类胡萝卜素含量的差异，而关于不同品种不同发育时期类胡萝卜素积累规律的研究还未见报道。笔者通过单因素和正交试验筛选出了南瓜果肉类胡萝卜素的最佳提取溶剂为无水乙醇，与前人研究结果一致[9]，但与已报道的南瓜果皮类胡萝卜素最佳提取工艺不同[10]。利用有机溶剂浸提类胡萝卜素，主要是依据“相似相溶”原理，南瓜果肉与果皮类胡萝卜素提取的最佳溶剂不同，可能是因为不同部位类胡萝卜素主要组成类别不同导致的，这需要通过高效液相色谱法进一步解析材料中的类胡萝卜素种类。5个南瓜品种不同发育时期类胡萝卜素含量变化的结果表明，同一品种，随着成熟度的增加，类胡萝卜素含量显著增加。类胡萝卜素含量最高的品种‘迷你荃鑫’，从花后21 d到采收期类胡萝卜素含量一直显著增加，在花后49 d进入平台期，含量无显著增加。这说明类胡萝卜素含量高的南瓜品种，果肉类胡萝卜素的积累不仅开始的时期较早，而且积累的时间更长。南瓜果肉中类胡萝卜素在花后21 d开始显著增加，花后28～42 d为快速积累期，这一时期刚好是南瓜果实膨大基本完成，开始成熟转色的时期，也是干物质积累的关键时期。另外不同品种间随着成熟度的增加，类胡萝卜素含量差异也在逐渐变大，相同的栽培条件下，不同品种类胡萝卜素含量差异明显。说明南瓜中类胡萝卜素含量的差异主要是由品种不同导致的，生产上需要高类胡萝卜素含量的南瓜，品种选择尤为重要。‘荃鑫6号’‘绿圆’和‘黑晶’3个品种在花后49 d左右类胡萝卜素的积累趋于稳定，‘迷你荃鑫’和‘早丰蜜’直到56 d即果实采收期类胡萝卜素仍处于快速积累期，这说明不同类型的南瓜类胡萝卜素积累规律存在差异，果实采摘后适当后熟可能利于类胡萝卜素更充分的积累。近年来，南瓜的保健价值越来越受到广大消费者的青睐，本研究可以为南瓜保健品开发、深加工及品质育种提供参考。

综上，南瓜果肉类胡萝卜素提取的最佳工艺条件为，在超声波辅助下，利用无水乙醇为提取溶剂，料液比1∶4，浸提8 min，共抽提4次。成熟期5个品种类胡萝卜素含量依次为:‘迷你荃鑫’>‘黑晶’>‘荃鑫6号’>‘绿圆’>‘早丰蜜’。不同南瓜品种中类胡萝卜素的积累规律存在差异，5个品种南瓜果肉类胡萝卜素含量在花后28～49 d均显著增加，因此推测，花后28～49 d可能是大多数南瓜品种类胡萝卜素合成与积累的关键时期。