茄子对褐纹病的抗性及其生理响应

李 可，金 辉，邹华芬，高晓敏，闫海霞，王琚钢

(1.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 广东湛江 524091；2.内蒙古自治区呼和浩特市环境监测中心站 呼和浩特 010030)

茄子(Solanum melongenaL.)是一种世界性栽培蔬菜，但易遭病害侵袭而造成大面积减产和品质下降[1]。茄子褐纹病(Phomopsis blight of eggplant)是由茄褐纹拟茎点霉(Phomopsis vexans)引起的一种病害，又称褐腐病、干腐病，与黄萎病(EggplantVerticilliumwilt)、青枯病(Eggplant bacterial wilt)并称为茄子的三大病害[2]。该病多在高温多雨季节发生，初期并无明显症状，一旦出现明显症状会严重影响茄子的商品价值[3]。依据陈姗姗等[4]的介绍，茄子褐纹病发病症状为:发病叶片病斑呈圆形或不规则形，边缘暗褐色，中间为灰白色至淡褐色病斑，其轮生许多黑色小点粒；果实上产生近圆形凹陷病斑，初为浅褐色，后变为暗褐色；病斑上常密生同心轮纹状排列的小黑点。广东省作为“南菜北运”主产区之一，冬季潮湿多雨，茄子褐纹病的发病率高，一般腐果率达30%～40%，留种田内发病更为严重，给茄子种植户和育种工作者带来极大困难[3]。

目前关于茄子褐纹病的研究相对较少，Mahadevakumar等[5]调查了印度卡纳塔克邦茄子褐纹病流行的主要时间、发病率，并对病原菌进行了分子表征；黄蔓叶片提取物[1]、苯并咪唑[2]和木霉属真菌(Trichodermaspp.)[3]均被证实可抑制茄子褐纹病的发生和病原菌生长；陈姗姗等[4]系统综述了国内茄子抗褐纹病育种工作。但目前茄子在褐纹病病原菌侵染后的生理生化抗性响应机制尚不清楚[6]。从病原菌微生物接触寄主开始，植物自身会发生一系列生理生化反应以应对病原菌侵染，抗性响应系统越强，植物对病原菌的抵抗力越高[7]。近年来，大量植物病害相关研究表明，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase，PAL)等保护酶和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)在植物的抗病应答中发挥着重要作用[8-9]；SOD、POD和CAT是植物体内主要的活性氧清除酶，可帮助植物抵抗活性氧带来的侵害。PPO可催化酚类物质氧化成醌，对病原菌的繁殖起到抑制作用[10]。而POD也被证实参与苯酚类和植保素等物质的合成[11]。PAL是植物抗病代谢过程中莽草酸途径的关键酶和限速酶，与细胞内木质素生成和沉淀有关[12]，可诱导植物细胞壁形成物理屏障物，阻止病原菌侵入细胞内，进而参与植物的抗病过程[9]。

笔者首先对疑似发生褐纹病的茄子叶片及果实中病原菌进行分离纯化，利用纯化病原菌和不同茄子材料进行了盆栽试验，然后测定不同材料的发病率，根据发病率计算出苗期和结果期病情指数。然后测定接种病原菌后的8 d内，不同茄子材料叶片内SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性及MDA 含量的变化规律，以期从生理生化水平揭示不同茄子材料对褐纹拟茎点霉的抗性响应机制，研究结果可为筛选茄子抗褐纹病品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分离纯化及鉴定

2016年在中国热带农业科学院南亚热带作物研究所实验基地采集症状明显的疑似病果，后续试验在海南省热带作物营养重点实验室进行。将疑似病果用无菌水冲洗干净后晾干，然后用75%乙醇进行表面消毒。用灭菌的解剖刀片在病健交界处切取果实组织，用吸水纸吸取多余水分，然后将其接种于PDA培养基中[13]，每皿接入5块发病组织，置于28℃恒温培养箱中培养。菌落长满整个培养基之后再进行2～3代的继代培养，纯化后的病原菌置于4℃冰箱中备用。

将纯化后的病原菌继续培养，待其在PDA培养基上长出黑褐色斑点，用灭菌牙签挑取斑点置于载玻片上，用LEICA DM 2500显微镜镜检，观察分生孢子器形状及孢子大小，并依据真菌鉴定手册[14]和中国真菌志[15]中所介绍的菌落形态、分生孢子器形态对病原菌进行鉴定。

1.2 供试茄子材料

供试茄子品种为市售‘黑贵长茄’和‘长丰二号’。2017年4月在中国热带农业科学院南亚热带作物研究所试验基地进行试验。将茄子种子催芽后播于育苗穴盘，育苗基质为丹麦品氏托普泥炭营养土。当幼苗第2片真叶完全展平时，将其移栽至10 cm×10 cm的营养钵中，转移至试验基地遮阳棚中，以供后续试验。

1.3 苗期抗病性鉴定

待茄子苗龄达60 d时，采用喷雾法接种[16]，配制孢子浓度为 1×106个·mL-1病原菌悬浮液[17]，在叶片正反面均匀喷施，用硫酸纸袋将植株叶片套袋2 h以保证病菌孢子全部接种在叶片上。对照处理喷施等体积无菌水。3次重复，每次重复10盆，每盆1株，正常田间管理。接菌10 d后，每隔2 d进行1次病情调查。

叶片侵染的分级标准如下:

0级:健康，叶片不发病；

1级:轻微感病，叶片只有1/3面积出现轻微黄色病斑症状；

2级:症状明显，叶片只有1/2面积有不规则形的黄色病斑；

3级:症状较重，叶片上有大面积黄色或者褐色病斑，边缘略有卷枯；

4级:所有叶片都感病，多为褐色枯斑，有少数叶片凋落；

5 级:整株死亡[5]。

病情指数计算公式如下:

1.4 结果期抗病性鉴定

当苗龄达到60 d时，将其移栽至规格为上口直径40 cm、基部直径35 cm、高45 cm的花盆中，正常肥水管理，待植株挂果达到3～6个，果实长度约为15～20 cm时，采用“十字”法进行活体果接菌试验[18]，将健康的茄子果实表面用无菌水冲洗干净，滤纸拭去多余水分，用灭菌解剖刀在果实近果蒂5 cm和靠近果尾5 cm处分别划5 mm×5 mm的“十字”伤口，用直径6 mm的圆形滤纸片蘸取浓度为1×106个·mL-1的孢子悬浮液，再用灭菌镊子取圆形滤纸片放于果实“十字”伤口处，然后将其放置在温度为28～30℃、相对湿度为70%的气候培养箱中进行培养。对照为无菌水处理。每株3个果实，每盆1株，每次重复10盆，3次重复。接菌处理7 d后统计发病率，每隔1 d进行1次调查，共调查5次，统计发病果实上的病斑面积，按病斑面积占茄子果实单面表面积百分比(LSP)进行分级。根据蔬菜病虫害诊断中茄子褐纹病诊断标准[19]诊断病害。

果实侵染的分级标准如下[18]:

0级:果实无发病；

1级:果实出现水渍状病斑，LSP≤10%；

2级:果实出现浅褐色椭圆形四陷斑10%

3级:果实出现浅褐色至暗褐色的圆形或者近圆形四陷斑，30%

4级:病果果肉凹陷呈腐烂状具有明显的同心轮纹，40%

5级:病果果肉凹陷腐烂，病部密生许多黑色小点粒，LSP>50%。

1.5 叶片生化指标测定

将新育好的茄子幼苗按照方法1.3进行接菌培养。在培养的过程中，每次重复30株进行生化指标的测定:10株测定SOD、POD和CAT活性，10株测定PPO和PAL活性，10株测定MDA含量。在接菌的 0、2、4、6、8 d 分别取叶片，用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定5种防御酶活性和MDA含量。各时间点变化率计算公式如下:

正值即为增幅，负值即为降幅。

1.6 数据分析

数据采用MicrosoftExcel2010处理，用SPSS20.0进行单因素随机区组试验方差分析，使用Origin Pro 8软件绘图。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

从茄子疑似病果中分离微生物，在27℃下PDA培养基上培养6 d后，菌落长满培养基，再经过2次继代培养，纯化完成，此时菌落形态呈白色毛绒状，均匀分散在培养基上(图1 a)；继续培养6 d后，在其白色绒毛上发现了散生的黑色小点(图1 b)，疑为病原菌的分生孢子器，显微镜下观察，其形状接近椭圆形(图 2 a)，大小约为(5～8)μm×(2～8)μm(图2 b)。依据菌落形态、分生孢子器形态大小以及真菌鉴定手册和中国真菌志中的描述，确定疑似病果中分离纯化的微生物为褐纹病病原菌茄褐纹拟茎点霉。

图1 茄子褐纹病病原菌在PDA培养基上纯化的菌落形态(a)及分生孢子器(b)

图2 不同显微镜倍数(a:100倍，b:400倍)下褐纹病菌分生孢子器镜下形态

2.2 不同品种苗期和结果期对病原菌的抗性

不同品种茄子回接病原菌后，均出现褐纹病感染症状。苗期叶片接种后2个品种的发病率均较对照差异显著，‘黑贵长茄’发病率达到64.98%，而‘长丰二号’为47.61%(图3-A)，且2个品种之间存在显著差异；2个品种苗期接种后的病情指数同样符合此规律，‘长丰二号’的病情指数显著低于‘黑贵长茄’(图3-B)。而结果期回接试验也表明，‘长丰二号’的果实发病率和病情指数均低于‘黑贵长茄’，且二者之间差异显著(图3)。‘黑贵长茄’较‘长丰二号’更容易发生褐纹病。因此，将‘黑贵长茄’作为本次研究中的易感褐纹病材料，将‘长丰二号’为本次研究的较抗褐纹病材料。

2.3 不同抗性茄子感染病原菌后叶片生化指标的变化

图3 茄子苗期及结果期接种鉴定的发病情况

接种褐纹病病原菌后，2种茄子的酶活性变化均呈现先增加后降低的趋势。‘长丰二号’的SOD酶活性变化率一直高于‘黑贵长茄’；在接菌第2天达到峰值，‘长丰二号’和‘黑贵长茄’的SOD酶活性变化率分别达到14.88%和12.26%(图4-A)。由图4-B可知，接种后2个品种茄子的POD酶活性变化率均逐步增加，且酶活性变化率差异显著；‘长丰二号’和‘黑贵长茄’的POD酶活性变化率均在接菌4 d后达到峰值，分别达到26.31%和15.49%，随后二者的酶活性变化率逐渐下降。CAT酶活性(图4-C)和PPO酶活性(图4-D)的变化规律和POD酶活性的变化规律几乎完全相同。PAL酶活性变化规律(图4-E)也与上述3种酶基本类似，不同的是，在接种病原菌第2天后，2种茄子的PAL酶活性值达到最大，之后呈现急剧下降趋势。而由图4-F可知，接种褐纹病病原菌后2种茄子的MDA含量变化率差异显著，在接种第4天达到峰值，二者的变化率分别为21.31%和10.03%，之后MDA含量迅速下降。

图4 不同抗性茄子接菌褐纹病菌后超氧化物歧化酶(SOD)(A)、过氧化物酶(POD)(B)、过氧化氢酶(CAT)(C)、多酚氧化酶(PPO)(D)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)(E)活性和丙二醛(MDA)(F)含量的变化

3 讨论

茄子褐纹病的病原菌为茄褐纹拟茎点霉，这在许多研究中已被证实[1-5]。本研究从疑似感染褐纹病的茄子果实中纯化培养微生物，菌落、分生孢子器的形态特征均符合真菌鉴定手册中的介绍；苗期和结果期的病原菌回接试验也证实，2个品种的茄子在回接微生物后产生了明显的褐纹病感染症状[5]，因此确定纯化后的微生物为茄褐纹拟茎点霉。病情指数是全面考虑发病率与严重程度的综合指标，和发病率相比，更能反映植物对病害的抗性响应。和‘长丰二号’相比，‘黑贵长茄’在回接试验中苗期和结果期的发病率比‘长丰二号’高17.37%和42.99%，而病情指数则高出0.22和0.4。这表明，‘长丰二号’不仅能降低褐纹病的发病率，更主要的是降低了发病的严重程度。因此在后续茄子育种工作中，可考虑将‘长丰二号’作为一个抗褐纹病材料。

植物体受到病原菌侵染时可引发植物产生活性氧，进而导致氧化胁迫[20]；活性氧对病原菌有一定的杀伤或抑制作用，产生活性氧的量与其自身的抗性有关，过多的活性氧则影响植物自身的生理活动，引发植物产生膜脂过氧化反应，导致细胞死亡[21]；而SOD、POD及CAT是植物体内主要活性氧清除酶[22]。在本研究中，未接菌的2个处理中，‘长丰二号’的SOD、POD和CAT酶活性均高于‘黑贵长茄’；接种褐纹病病原菌后，2个材料叶片内的3个指标较各自对照均有所升高，但‘长丰二号’的3个指标与对照(未接菌)相比的增加量要高于‘黑贵长茄’；这表明植株体内的保护酶活性大小与品种的基础抗性有关[23]，且‘黑贵长茄’叶片内的活性氧清除系统对来自外界胁迫的响应速度较为迟缓。无论是‘长丰二号’还是‘黑贵长茄’，保护酶活性在达到峰值后迅速下降，这意味着植物体内的保护酶对活性氧的清除能力在一定时间内有效，保护酶活性过高或者过低并不能一直清除多余活性氧[24]。PPO也被认为是植物体内活性氧清除酶，但它也是引起植物褐变的主要因素，2种茄子接菌后，叶片内PPO酶活性呈现先升高后降低的趋势，这可能与植株体内活性氧清除系统的自我调节有关[25]。叶片内PAL酶活性在接菌第2天达到最大值，‘长丰二号’较对照变化最显著，PAL酶活性达到最大。这说明‘长丰二号’在受到病原菌侵染时，可以形成更多的木质素或者其他抗病的次生代谢产物，来增加自身的抗病性和免疫能力[26]。MDA含量与茄子褐纹病的抗性呈负相关关系，此结果与前人研究的结果一致[27]，茄子在受到褐纹病病原菌侵染后，‘长丰二号’MDA含量的变化率低于‘黑贵长茄’，说明‘长丰二号’受到病原菌侵害后膜质伤害程度小，这与‘长丰二号’有一个较强的活性氧清除系统是一致的。