加米霉素注射液对猪呼吸道常见病原菌的体外抗菌活性研究

康彦 邓菲 王海

摘要：试验旨在研究加米霉素注射液对猪呼吸道常见病原菌的体外抗菌活性。采用微量肉汤稀释法测定了加米霉素注射液及对照组替米考星注射液对猪呼吸道主要病原菌临床分离株的最小抑菌浓度MIG。微量肉汤稀释法实验结果表明，加米霉素对链球菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌等猪呼吸道疾病主要病原菌有良好的抗菌活性，其抗菌作用显著优于替米考星（ Ps0.05）。

关键词：加米霉素;微量肉汤稀释法;体外抑菌活性;副猪嗜血杆菌;多杀性巴氏杆菌;链球菌;传染性胸膜肺炎

加米霉素（ Gamithromycin）是由法国梅里亚公司研发的一种新型动物专用大环内酯类半合成抗生素，通过抑制细菌RNA依赖性蛋白合成而起抑菌和杀菌作用，对猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌等引起猪呼吸系统疾病的病原菌有很强的抗菌活性。

目前，在我国大环内酯类药物现行使用较为广泛的是替米考星，该药物用于预防或治疗猪的呼吸系统疾病，通常采用拌料或饮水的给药方式，达到预防或治疗的效果需要多天重复给药。虽然取得了良好的效果，但随着使用时间的延长，在很多地区出现了不同程度的耐药性，随着用量不断增大，治疗效果却在逐步降低。加米霉素注射液与替米考星相比，具有单次注射给药吸收迅速、生物利用度高、低残留、安全性高、一次给药持效时间长等比较优势。在欧盟，美国、加拿大等国家已被用于预防和治疗猪的呼吸系统疾病，并取得了良好的效果。

本文根据美国临床实验室标准化委员会（ CLSI）规定的抗菌药物敏感性检测方法要求，开展了加米霉素注射液对猪呼吸系统疾病主要病原菌临床分离株的体外抗菌活性试验研究，为指导临床用药和后续的新药申报提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药品

加米霉素原料药：含量99.61%，比号：GMM04，由华北制药集团动物保健品有限责任公司公司提供;

替米考星原料药：含量89.5%，批号：TMC1610151，购自山东鲁抗医药股份有限公司。

1.1.2菌株

质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213，由南京农业大学兽医药理组保藏。

临床分离菌株：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌11株、副猪嗜血杆菌18株、猪多杀性巴氏杆菌株1 1株、猪链球菌18株，由南京农业大学兽医微生物学与免疫学实验室馈赠。

1.1.3培养基和试剂

培养基：MH肉汤、NB营养肉汤、CAMHB肉汤等培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

其他试剂：脱纤维绵羊血购自北京华奥科安科技有限公司;小牛血清购自平瑞生物科技有限公司;革兰氏染液购自南京建成生物科技有限公司。

1.1.4主要仪器和设备

超净工作台：Hfsafe-1200/C型，上海力申科学仪器有限公司;

电热恒温培养箱：DNP-9162-1型，常州冠军仪器制造有限公司;

冰箱：BCD-251WDBD型，青岛海尔股份有限公司;

全自动高压灭菌锅：HVE-50型，华粤行仪器有限公司;

电子天平：JD300-3型，沈阳龙腾电子有限公司;

生物显微镜：NIKON ElOO型，尼康儀器（中国）有限公司 可调微量移液器：20-200μL、100-1000μL规格，德国Eppendorf公司;

多道微量移液器：100-300μL规格，上海大龙设备公司 紫外可见分光光度仪：Spectrum SP2100UV型，上海光谱仪器有限公司

1.2试验方法

1.2.1药品储备液的制备

0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH6.0）：量取1 mol/L的磷酸二氢钠2.6 mL，1 mol/L的磷酸氢二钠17.4 mL，于100mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。

加米霉素溶液的制备：准确称取0.129g加米霉素原料药，在超声波破碎的帮助下，用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（ pH 6.0）溶解并定容至25mL，即配成5120μg/mL的储备液，过滤除菌，分装，-20℃保存。

替米考星溶液的制备：准确称取0.143g替米考星原料药，用95%乙醇溶解并定容至25mL，即配成5120μg/mL的储备液，过滤除菌，分装，-20℃保存。

1.2.2菌液的制备

冻存的质控菌株和试验菌株复苏后，接种琼脂平板，置37℃过夜培养，挑取1个单菌落接种于MH培养液（链球菌用含有5%小牛血清的CAMHB肉汤），置37℃9呼育16 - 18h。获得的菌液稀释适当倍数用紫外可见分光光度仪测定OD600值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约为1×108cfu/mL。之后用液体培养基按1：100稀释作为试验菌液（1×106cfu/mL）。

1.2.3药敏试验的操作

1）将加米霉素储备液和替米考星储备液用灭菌的MH肉汤进行稀释至需要浓度，待用;

2）无菌96孔板第1—11列加入灭菌MH肉汤100μL;

3）无菌96孔板第1列加入适宜浓度的药液100μL，逐次倍比稀释至1 1列;

4）无菌96孔板的第1—1 1列加入待测菌液100μL，每孔液体的终体积是200μL，每一行为一株菌，一株菌做两行;

5） 第12列上4孔加入200μL/孔灭菌MH肉汤作为阴性对照，第12列下4孔加入200μL/孔菌液作为阳性对照。

6）每种菌设置溶剂对照组，步骤同上。

7）药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱培养18-22h，观察结果。

1.2.4药敏试验质控

按美国CLSI规定：（1）质控菌株应按标准方法与临床标本种分离菌同步进行药敏试验;（2）更换药物或培养基时必须用相应质控菌株测试;（3）每批次试验均需同步进行质控菌的药敏检测。

1.3数据处理

数据用Microsoft Excel软件处理，处理后用SPSS 20.0软件进行机率单位加权回归法（Bliss法）计算MIC50和MIC90。

2.结果

MIC测定结果见表1一表4，采用SPSS 20.0软件分析表中数据可知，加米霉素对18株链球菌、18株副猪嗜血杆菌、1 1株多杀性巴氏杆菌、10株传染性胸膜肺炎放线杆菌的vIC分别在0.125 - 1.OOμg/mL、0.125- 2.OOμg/mL、1.00 - 2.OOμg/mL、1.00 - 2.OOug/mL之间，MIC50和MIC90分别为0.26μg/mL和0.59μg/mL、0.26μg/mL和0.58μg/mL、1.30μg/mL和2.25μg/mL、0.68μg/mL和1.89μg/mL。替米考星对1 8株链球菌、18株副猪嗜血杆菌、11株多杀性巴氏杆菌、10株传染性胸膜肺炎放线杆菌的MIC分别在1 .00-8.OOμg/mL、1.00--16.00μg/mL、8.00-64.OOμg/mL、4.00-32.OOμg/mL之间，MIC50和MIC90分别为2.01μg/mL和3.75μg/mL、3.08μg/mL和7.82μg/mL、13.94μg/mL和31.11μg/mL.7.44μg/mL和15.80μg/mL。

3讨论

加米霉素（ Gamithromycin）是由法国梅里亚有限公司率先研制，其商品名为Zactran，2016年2月，欧盟批准其用于治疗由胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌引起的猪呼吸系统疾病（ SRD）。EMA报道了加米霉素对引起猪呼吸系统疾病（ SRD）的胸膜肺炎放线杆菌（ n=100）、多杀性巴氏杆菌（ n=100）、副猪嗜血杆菌（n=67）的MICso分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL和1¨g/mL，对上述病原菌的MIC90分别为0.5μg/mL、1μg/mL、和2μg/mL，这与本实验结果研究一致。试验表明加米霉素对副猪嗜血杆菌、多殺性巴氏杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、链球菌等猪呼吸道疾病主要病原菌有良好的抗菌活性，其抗菌作用显著优于替米考星（P≤0.05）。