利用重组胰蛋白酶对鳗鱼下脚料酶解生产复合氨基酸及产品中钙的测定

廖晓峰,于荣

(1.东华理工大学 化学与生物材料学院,南昌 330038；2.东华理工大学 水资源与环境工程学院,南昌 330038)

鳗鱼是我国重要的经济鱼类，近年来由于福建、广东、江苏、浙江等鳗鱼主产地水质恶化，很多养殖企业转移到江西省，是江西省重要的出口创汇渠道之一。鳗鱼养殖与加工企业在江西省各地都有，年产烤鳗数万吨。但鳗鱼加工企业都面临大量鳗鱼加工剩余的下脚料无法处理，下脚料因为江西省内没有厂方收购，只有卖给沿海一带收购方处理，但路途远，该下脚料又含有高蛋白、高脂肪，外运难以保质保鲜，很多下脚料没有得到有效、合理的利用，还会造成环境污染，浪费资源，也影响环境，因此鳗鱼下脚料综合处理问题日益迫切，目前江西省内还是空白。本项目对鳗鱼下脚料进行综合处理，生产复合氨基酸、鳗鱼蛋白粉等产品，可以作为食品鲜味剂原料，也可以作为高级酱油原料。鳗鱼粉含多种氨基酸，特别是鲜味氨基酸含量高，且钙含量非常高，适合制作中老年人的强化钙，儿童的调味品基料，例如儿童强化酱油、中老年强化酱油、强化鲜味粉、鲜味汤料、鳗鱼精等产品，提高资源利用率，保护环境[1-4]。

鳗鱼下脚料综合处理研究在江西省还是一个空白，国内外对鳗鱼研究主要集中在鳗鱼养殖及加工方面。烤鳗生产后的下脚料由于富含高蛋白，利用蛋白质酶解技术对鳗鱼下脚料进行酶解，再经过均质、喷雾干燥等工艺，生产复合氨基酸、鳗鱼蛋白粉等产品，既可以为企业解决环境污染的后顾之忧，又可以为企业带来新的经济增长点，还可以促进就业和带动鳗鱼养殖及加工业的发展。

1 理论依据与实验基础、研究目的

鳗鱼肉蛋白富含赖氨酸及精氨酸，重组胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可特异切割赖氨酸及精氨酸C末端肽键，是由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致，重组猪胰蛋白酶具有与动物源性猪胰蛋白酶相同的酶学性质。重组胰蛋白酶分子量为24 kD，最适pH为7.0～11.0。前期实验结果表明，重组胰蛋白酶对鳗鱼蛋白水解最好，前期实验通过几种不同蛋白酶对鳗鱼下脚料的酶解实验结果证实胰蛋白酶酶解效率最好。实验选用上海雅心生物技术有限公司生产的重组胰蛋白酶为酶解制剂，目的是研究酶解的最佳工艺条件及产品中蛋白质和钙的含量测定方法。

2 材料与方法

2.1 仪器

CL-3型恒温加热磁力搅拌器 上海梅颖浦仪仪器有限公司；BS223S分析天平 赛多利斯电子天平仪器有限公司；UV751GD紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；WFX-120原子吸收分光光度计 北京百分瑞利仪器有限公司。

2.2 原料及试剂

鳗鱼带肉骨：选取新鲜无腐败的鳗鱼带肉骨作原料，江西华谊食品有限公司提供；重组胰蛋白酶：上海雅心生物技术有限公司(要求酶活在20万U/g以上)。

2.3 制备工艺[5]

2.3.1 工艺流程

鳗鱼带肉骨→预处理→净鳗鱼带肉骨→烘干→干鳗鱼带肉骨→粉碎、均质→鳗鱼肉骨粉→水提→鳗鱼肉骨粉料液→酶解→酶解液→均质→喷雾干燥→成品。

2.3.2 工艺过程

2.3.2.1 预处理

鳗鱼带肉骨经筛选、整理后,于50 ℃温水浸泡30 min，去除杂质，清水洗净，沥干待用。

2.3.2.2 烘干

预处理后的原料置于干燥箱中干燥，干燥温度为80 ℃，时间5～6 h。

2.3.2.3 粉碎、均质

干燥好的原料粉碎，粉碎后再加入10倍的蒸馏水调匀，高压均质机均质，得到鳗鱼骨粉料液。

2.3.2.4 酶解

均质后的料液放入酶解器中，预热至45 ℃后恒温，用20%的氢氧化钠调节pH至7.0～9.0左右，再按2%～5%投料量将重组胰蛋白酶投入(添加胰蛋白酶的目的是利用胰蛋白酶将鳗鱼肉蛋白水解成氨基酸，得到高含钙的复合氨基酸混合液，再经均质、喷雾干燥等工艺生产蛋白钙及蛋白粉产品，通过前期实验研究表明胰蛋白酶对鳗鱼肉的酶解效率高)，搅拌20 min，然后加热至60～80 ℃(10 min),使原料酶解。

2.3.2.5 喷雾干燥

将均质后的酶解液经过喷雾干燥，得到产品。

2.3.2.6 蛋白质含量的测定[6]

将酶解液在波长为215 nm和225 nm的紫外分光光度计下分别测定其吸光值，计算蛋白质提取率。

本次实验采用215 nm和225 nm的吸收差法测定蛋白质，用215 nm和250 nm外光吸收差值与单一波长测定相比，可减少误差。

蛋白质浓度(mg/mL)=0.144×(A215-A225)。

测定区间：20～100 μg蛋白质/mL。

蛋白质提取率(%)=原料中蛋白质含量/酶解液中蛋白质含量×100/100。

3 结果分析

3.1 单因素实验对酶解结果的影响[7-11]

3.1.1 加酶量的影响

称取原料20 g，加入10倍水研磨，后按2%，3%，4%，5%投料量将胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，45 ℃恒温,反应时间为60 min,将pH调节到8.0的条件下进行酶解，结果见表1。

表1 加酶量对酶解过程的影响Table 1 The effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis process

由表1可知，随着加酶量的增加，蛋白质的提取率下降，在加酶量为2%时蛋白质的提取率最高，加入过量的酶可能导致蛋白质降解。经测定，原料中蛋白质平均含量为32.42%，但在原料预处理过程中蛋白质有所损失，胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可特异切割赖氨酸及精氨酸C末端肽键，故胰蛋白酶在对蛋白质酶解过程中酶解不完全，不能完全酶解原料中的蛋白质，造成蛋白质提取率不是很高，但能满足生产要求。

3.1.2 温度的影响

称取原料20 g，加入10倍水研磨，按3.1.1的最佳结果按2%投料量将重组胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，恒温40，45，50，55 ℃,反应时间为30 min,将pH调节到8.0的条件下进行酶解，结果见表2。

表2 温度对酶解过程的影响Table 2 The effect of temperature on the enzymatic hydrolysis process

由表2可知，重组胰蛋白酶活性温度范围是40～45 ℃，比一般的酶活性温度要高，当温度为45 ℃时，蛋白质的提取率最大，温度再升高，酶分子结构发生变化，分子间碰撞加剧，导致酶分子结构破坏，蛋白质的提取率下降。

3.1.3 时间的影响

称取原料20 g，加入10倍水研磨，按2%投料量将胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，恒温45 ℃(3.1.2的最佳结果),反应时间为1，2，3，4 h,将pH调节到8.0的条件下进行酶解，结果见表3。

表3 反应时间对酶解过程的影响Table 3 The effect of reaction time on the enzymatic hydrolysis process

由表3可知，当反应时间达到3 h时酶解基本完全，此时的提取率最高。反应时间过长，可能导致水解蛋白质变性分解，当反应时间达到3 h时最佳。

3.1.4 pH值的影响

称取原料20 g，加入10倍水研磨，后按3.1.1的最佳结果按2%投料量将重组胰蛋白酶投入，按3.1.2的方法恒温45 ℃(3.1.2的最佳结果),反应时间为3 h(3.1.3的最佳结果),将pH调节到6.0，7.0，8.0的条件下进行酶解，结果见表4。

表4 pH值对酶解过程的影响Table 4 The effect of pH on the enzymatic hydrolysis process

由表4可知，pH值在8.0时蛋白质的提取率最大，随着pH值再增大，重组胰蛋白酶结构会发生改变，导致重组胰蛋白酶活性减小。

3.2 正交实验

正交实验因素水平见表5，正交实验结果见表6。

表5 实验因素水平表Table 5 Table of experimental factors and levels

表6 正交实验结果Table 6 The experimental results

由表6可知，极差值R为因素A(0.25)，B(0.33)，C(0.26)，故影响蛋白质提取量的因素的主次关系为B(反应温度)>C(pH值)>A(反应时间)。比较这9次实验的结果， 第5次实验的蛋白质的提取率29.7%最大，因此A2B2C3是最好的搭配。

3.3 酶解液钙含量的测定

方法:石墨炉火焰原子吸收分光光度法。

仪器：WFX-200石墨炉火焰原子分光光度仪，北京百分瑞利仪器有限公司。

3.3.1 原理

样品经湿法消化后，导入原子吸收分光光度计中，经火焰原子化后，吸收422.7 nm处的共振线，其吸收量与含量成正比，与标准系列比较定量。

3.3.2 主要试剂

混合酸消化液：硝酸与高氯酸比为4∶1。

2%氧化镧溶液：称取25 g氧化镧(纯度>99.99%)，加75 mL盐酸于1000 mL容量瓶中，加去离子水稀释至刻度。

钙标准溶液：精确称取1.2486 g碳酸钙(纯度>99.99%),加50 mL去离子水，加盐酸溶解，移入1000 mL容量瓶中，加2%氧化镧稀释至刻度。贮存于聚乙烯瓶内，4 ℃保存。此溶液每毫升相当于500 μg钙。

钙标准使用液：钙标准使用液的配制见表7。

表7 钙标准使用液配制Table 7 The preparation of calcium standard liquid

钙标准使用液配制后，贮存于聚乙烯瓶内，4 ℃保存。

3.3.3 测定

将钙标准使用液分别配制不同浓度系列的标准稀释液(见表8)，测定操作参数见表9。

表8 不同浓度系列标准稀释液的配制方法Table 8 The preparation method of different concentration series of standard diluent

表9 测定操作参数Table 9 Measurement of operating parameters

3.3.4 标准曲线

以各浓度系列标准溶液与对应的吸光度绘制标准曲线,钙离子的标准曲线见表10和图1。

表10 钙离子标准曲线Table 10 The standard curve of calcium ion

图1 钙离子的标准曲线Fig.1 The standard curve of calcium ion

由图1可知，线性相关系数为0.9996。测定样品液及空白液A,由标准曲线查出浓度值(c及c0)，再按下式计算。

式中：X为样品中元素的含量，mg/100 g；c为测定用样品中元素的浓度，μg/mL；c0为试剂空白液中元素的浓度，μg/mL；V为样品定容体积，mL；f为稀释倍数；m为样品质量。

3.3.5 样品中钙离子含量的测定

将酶解液定容至50 mL，从中取1 mL稀释至10 mL，用原子吸收法测定钙离子，所得数据见表11。

表11 钙离子含量的测定Table 11 The determination of calcium ion content

由表11可知，数据计算可以得出钙的平均含量为47.98 μg/mL。

4 结论

采用鳗鱼带肉骨作为原料，预处理后用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白钙。实验结果表明：酶解的最佳条件是在pH为8.0、温度为45 ℃、加酶量为2%、酶解时间为3 h的条件下进行实验。利用紫外分光光度法在215 nm和225 nm的差值下测定产品中蛋白质的含量，用石墨炉原子吸收法测定产品中钙的含量，产品蛋白质含量可达29.7%，钙的含量为4.79%。

鳗鱼骨是一种廉价的可再生资源, 从鳗鱼骨中提取复合氨基酸有较大的经济价值。产品中蛋白质含量可达27.5%～35%左右，钙的含量也非常高，并且是生物钙，有利人体的吸收。产品可以作为食品鲜味剂原料，也可以作为高级酱油原料，含多种氨基酸，特别是鲜味氨基酸含量高，且钙含量非常高，适合制作中老年人的强化钙、儿童的调味品基料，例如儿童强化酱油、中老年强化酱油、强化鲜味粉、鲜味汤料、鳗鱼精等产品。