法舒地尔对急性柯萨奇B3病毒性心肌炎小鼠的保护作用

李嘉 邰思超 王瑶尧 金戈 马骏 李岳春 余艳 廖伟芳 林加锋 戴克智

病毒性心肌炎多由柯萨奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）感染引起，病毒在心肌细胞内大量复制不但引起直接损伤，还刺激免疫细胞产生多种细胞因子介导免疫损伤[1-2]。传统认为Th1/Th2细胞比例失衡可能是影响病毒性心肌炎疾病进展和结局的因素之一[3]。近年来发现，由17型T辅助细胞（Th17细胞）产生的白细胞介素-17（IL-17）在心肌炎的急性和慢性病毒感染阶段均明显增多，提示在病毒性心肌炎发病过程中，IL-17作为重要的促炎细胞因子也参与了炎症反应[4-5]。

法舒地尔（fasudil）作为目前唯一批准用于临床的Rho激酶抑制剂，在防治蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛方面安全有效。近年来心血管病研究发现，法舒地尔可通过阻断RhoA/ROCK信号通路，与多种细胞因子、炎症因子及血管活性因子相互作用，在治疗心肌肥大、心力衰竭、冠状动脉痉挛、心绞痛、心肌梗死等方面应用前景广阔[6]。然而，国内外鲜有法舒地尔对CVB3感染后急性病毒性心肌炎影响的报道。本研究探讨法舒地尔对CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用及可能的机制，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物、细胞和病毒株 4周龄SPF级雄性BALB/c小鼠，体重（16.3±1.3）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。CVB3（Nancy株）购自美国ATCC公司。病毒经Hep2细胞（上海生化细胞所）活化增殖，滴度为107TCID50/0.1ml。

1.2 主要药品与试剂 盐酸法舒地尔（商品名：川威，分子式：C14H17N3O2S·HCl，国药准字 H20040356，批号：1606241，规格：2ml∶30mg）购自天津红日药业。Trizol总RNA提取液和PVDF膜购自美国Invitrogen公司。逆转录和常规PCR试剂盒购自加拿大Fermentas公司。兔抗小鼠IL-17单克隆抗体、兔抗小鼠ROCK2抗体购自美国Santa Cruz公司。IL-17 ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，测量灵敏度为15pg/ml。血清乳酸脱氢酶和肌酸激酶微量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生存率实验 将80只小鼠按随机数字表法分为4组，分别为病毒性心肌炎组、低剂量法舒地尔治疗组、法舒地尔治疗组及正常对照组，每组20只，先进行生存率实验。设接种病毒日为第0天，病毒性心肌炎组、低剂量法舒地尔治疗组和法舒地尔治疗组经腹腔注射100TCID50/0.1的CVB3病毒稀释液0.1ml[7]，正常对照组经腹腔注射不含病毒的DMEM病毒培养液。在接种病毒次日（第1天）起，根据前期实验结果[8]，分别每日给予低剂量法舒地尔治疗组、法舒地尔治疗组5mg/kg、10mg/kg腹腔注射，共14d，病毒性心肌炎组和正常对照组每日腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液作为对照至第14天。观察上述4组小鼠生存率，并于第7天时用微量检测试剂盒检测4组小鼠的血清乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK），协助判断建模是否成功。由于生存率实验结果提示低剂量法舒地尔治疗组小鼠生存率较病毒性心肌炎组无明显改善，故后续正式实验取消设置低剂量法舒地尔治疗组。

1.3.2 正式实验的动物模型分组、制备及计算心脏重量/身体重量（HW/BW比值） 重新选择同批次90只小鼠，按照随机数字表法分为病毒性心肌炎组、法舒地尔治疗组（每日10mg/kg腹腔注射，共14d）和正常对照组，每组30只，重复上述实验，分别于第7、14天从各组抽取8只小鼠称重，再行超声心动图检查后抽血和取心脏标本（心脏称重后沿中线切为两半，一半经10%甲醛溶液固定后行病理组织学检查，另一半液氮速冻后保存在-80℃冰箱备用，做RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测），分别计算第7、14天小鼠的HW/BW比值。

1.3.3 超声心动图检查 小鼠给予3%水合氯醛（0.01ml/g）腹膜内注射麻醉成功，胸部备皮，取左侧卧位，使用Agilent Sonos 5500超声仪配备12MHz高频线阵探头，采用标准胸骨旁左心室长轴及短轴二维切面，测左心室舒张末期直径（LVEDd）和左心室收缩末期直径（LVESd），计算左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（FS）。上述指标取3个连续心动周期的平均值。

1.3.4 病理组织学检查 将10%甲醛溶液固定的心脏做厚约4μm常规石蜡切片并进行HE染色，每张切片取5个视野，光镜下观察心肌组织病理改变，心肌组织病理学评分由两名医生分别判断后取平均值。具体评判标准参照Rezkalla方法[9]计为：无病变为0分；病变（炎症细胞浸润、心肌坏死）占每张心脏切片视野面积≤25%为1分；＞25%～50%为2分；＞50%～75%为3分；＞75%为4分。

1.3.5 检测小鼠心肌 CVB3、ROCK2和 IL-17的mRNA的表达 取心肌组织剪碎匀浆，采用Trizol一步法抽提心肌总RNA，测定OD260/OD280的比值鉴定RNA质量。取总RNA2μg，采用Biotool逆转录试剂盒合成cDNA。然后进行PCR扩增，取10μl反应产物，再行2%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析处理，实验结果使用ImageJ软件处理，以β-actin作为内参照，计算CVB3、ROCK2和IL-17 mRNA的相对表达水平。PCR反应条件：预变性95℃ 3min，变性95℃ 30s，退火30s，延伸72℃ 60s，72℃终末延伸5min后终止反应，详见表1。

表1 引物序列、退火温度、循环次数及产物长度

1.3.6 测定心肌IL-17、ROCK2蛋白相对含量 将心肌组织研磨匀浆后提取总蛋白，进行蛋白质定量，常规制备SDS-PAGE胶电泳后、转移至PVDF膜、一抗封闭分别加入IL-17一抗（1∶500稀释）、ROCK2一抗（1∶500稀释）及 β-actin一抗（1∶2 500稀释），然后4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000稀释）室温孵育1h，ECL化学发光试剂盒显色，KwikQuantTM照相系统拍照并分析，以β-actin作为内参照，用ImageJ软件测量灰度值，计算IL-17及ROCK2蛋白相对量。

1.3.7 检测血清IL-17水平 血液样本离心后提取上层血清，采用双抗体夹心ELISA法测定各组小鼠血清IL-17水平，所有操作严格按试剂盒说明书由专人进行。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 6.0和SPSS19.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，若方差齐，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。若方差不齐则采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠的生存率实验结果 病毒性心肌炎组小鼠从第2～3天开始陆续出现进食减少、少动、拱背、精神淡漠、易激惹、相互撕咬等症状，于第4天开始死亡，第7天时小鼠血清LDH、CK明显升高（数据未显示），提示建模成功。法舒地尔治疗组小鼠则上述症状明显减轻，正常对照组小鼠无死亡且精神状态、饮食、活动均正常。4组小鼠的生存率实验结果见图1。

图1 4组小鼠的生存率实验结果

由图1可见，第14天时，病毒性心肌炎组、低剂量法舒地尔治疗组、法舒地尔治疗组生存率分别为45%（9/20）、55%（11/20）、75%（15/20），低剂量法舒地尔治疗组小鼠生存率较病毒性心肌炎组差异无统计学意义（P＞0.05），而法舒地尔治疗组生存率较病毒性心肌炎组显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 3组小鼠第7和14天HW/BW比值与心肌组织病理学评分比较 见表2。

由表2可见，病毒性心肌炎组第7天与第14天HW/BW比值均较高于正常对照组，法舒地尔治疗组HW/BW比值低于病毒性心肌炎组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与病毒性心肌炎组比较，法舒地尔组心肌切片炎症细胞浸润、心肌坏死明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。正常对照组心肌未发现病理改变。3组小鼠第7天与第14天心肌病理组织学变化见图2（见封三）。

图2 第7天与14天各组小鼠心肌病理组织学变化（A：病毒性心肌炎组第7天，B：病毒性心肌炎组第14天，C：法舒地尔治疗组第7天，D：法舒地尔治疗组第14天，E：正常对照组第7天；F：正常对照组第14天，均为H E染色，×200）

表2 3组小鼠第7和14天HW/BW比值与心肌组织病理学评分比较

2.3 3组小鼠第7天与第14天超声心动图测量结果比较 见表3。

表3 3组小鼠第7天与第14天超声心动图测量结果比较

由表3可见，与正常对照组比较，第7和14天时病毒性心肌炎组小鼠LVEDd和LVESd明显增大，LVEF和FS均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）而给予法舒地尔治疗组第14天后，上述指标较病毒性心肌炎组均明显改善，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 3组小鼠心肌组织 CVB3、ROCK2和 IL-17mRNA相对表达量的比较 见图3。

图3 3组小鼠心肌组织 CVB3、ROCK2和 IL-17mRNA 相对表达量的比较（A：CVB3 mRNA；B：ROCK2 mRNA；C：IL-17mRNA，注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与病毒性心肌炎组比较，△P＜0.05）

由图3可见，病毒性心肌炎组第14天的CVB3mRNA相对表达量低于第7天的CVB3mRNA相对表达量。法舒地尔治疗组第7、14天CVB3mRNA相对表达量均低于病毒性心肌炎组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。病毒性心肌炎组ROCK2mRNA和IL-17mRNA表达均高于正常对照组，其中，第7天ROCK2mRNA水平高于第14天，IL-17mRNA表达水平在第7天明显低于第14天。法舒地尔治疗组第7、14天心肌组织ROCK2mRNA、IL-17mRNA水平均较病毒性心肌炎组明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.5 3组小鼠心肌组织ROCK2、IL-17蛋白含量和外周血IL-17水平比较 见图4。

图4 3组小鼠心肌组织ROCK2、IL-17蛋白含量和外周血IL-17水平比较（A：ROCK2蛋白；B：IL-17蛋白；C：外周血IL-17水平；注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与病毒性心肌炎组比较，△P＜0.05）

由图4可见，第7天和第14天，病毒性心肌炎组小鼠心肌组织ROCK2、IL-17蛋白含量、IL-17水平均高于正常对照组，法舒地尔治疗组小鼠心肌组织ROCK2、IL-17蛋白含量和血清IL-17水平均明显低于病毒性心肌炎组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

本研究表明，法舒地尔减轻了病毒性心肌炎小鼠的心肌炎症损伤，可能与阻断RhoA/ROCK信号通路，下调炎症细胞因子IL-17水平有关。

既往研究发现，RhoA/ROCK信号通路在心肌肥大、缺血再灌注损伤、心肌细胞凋亡以及心肌纤维化时被激活，与多种细胞因子、炎症因子及血管活性因子等相互作用，参与上述心血管疾病的病理生理过程[6]。例如，急性心肌梗死后小鼠心肌Rho激酶的活性增高，促进多种促炎细胞因子的表达，在心肌梗死后左心室重构中发挥重要作用，而每日口服法舒地尔100mg/kg 4周后能显著抑制左心室重构，提示Rho激酶可能是防治心肌梗死后心力衰竭的潜在靶点[10]。Bao等[11]发现在小鼠冠状动脉结扎术前1h预先使用Rho激酶抑制剂，能够抑制缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡，降低IL-6水平，减少心肌梗死面积，并保护心功能。虽然急性病毒性心肌炎和急性心肌梗死后左心室重构及缺血再灌注损伤在病因和临床特征方面表现迥异，但在发病后继发的炎症反应和心肌损伤方面却存在共同炎症机制，近年来被统称为炎症性心脏病[12]。本研究表明，急性CVB3感染后小鼠心肌ROCK2 mRNA和蛋白含量表达均有升高，提示病毒感染激活了Rho激酶，而应用法舒地尔抑制RhoA/ROCK信号通路后，CVB3复制减少，心肌病理损伤减轻，心肌炎小鼠生存率提高，心功能得到改善。

近年来，Th17细胞及其分泌的IL-17被证明是加重CVB3感染后心肌炎发展的一大关键[4-5]。IL-17可促进多种免疫细胞在炎症部位聚集和炎症因子的释放[13]。例如，IL-17不但促进心肌炎小鼠巨噬细胞分泌IL-1β及肿瘤坏死因子α（TNF-α）加重心肌损伤，还能抑制淋巴细胞分泌IFN-γ[14]，而后者是公认的能抑制病毒复制的细胞因子。此外，IL-17还可抑制CD8+T细胞来促进病毒的复制，反之，应用抗体中和IL-17能减少病毒性心肌炎小鼠病毒复制及心肌损伤[15]。研究证实，抑制RhoA/ROCK通路可降低多种免疫性疾病中IL-17的水平，如法舒地尔可抑制IL-17和TNF-α在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中的表达[16]。类风湿性关节炎患者口服选择性ROCK2抑制剂后可减少IL-17的分泌高达60%以上，其机制可能与抑制ROCK2后减少了信号转导转录激活子3（STAT3）的磷酸化有关[17]。本研究证实，在急性病毒性心肌炎小鼠中，法舒地尔同样能抑制IL-17表达，从而抑制CVB3复制和减轻心肌病理损伤和改善心功能。

目前国内外少有法舒地尔治疗急性CVB3病毒性心肌炎的相关研究。袁丽等[18]发现，法舒地尔对成年BALB/c小鼠巨细胞病毒性心肌炎有一定的治疗作用，与本文结论一致。然而亦有报道，法舒地尔对脑心肌炎病毒感染的小鼠并无治疗作用[19]，但笔者认为该研究中法舒地尔治疗组小鼠每日口服用量仅为10mg/kg，远少于既往多项阳性结果的研究中每日 100mg/kg 的口服剂量[10，16，19]。而相关研究证实，后者口服剂量与本研究采用每日10mg/kg腹腔注射给药疗效相当[8]，从而支持本研究结论。

综上所述,本研究初步证实，法舒地尔作为已上市并广泛应用的老药，对CVB3诱发的急性病毒性心肌炎小鼠具有一定保护作用，这为急性病毒性心肌炎的治疗开辟新的思路。但法舒地尔的确切治疗效果还有待大量的临床对照试验来进一步证实。