施用棉秆炭连作棉花根际土壤真菌多样性与土壤理化性质及黄萎病的相关性

顾美英，徐万里，张志东，唐光木，刘洪亮，李志强，刘晓伟，蒲胜海，冯雷，张计峰

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所，乌鲁木齐 830091；3.石河子农业科学研究院，石河子 832000)

0 引 言

【研究意义】新疆棉花连作现象非常普遍，棉花高效、优质生产与黄萎病等土传病害防治之间的矛盾日益突出[1]。研究表明，土壤微生态失衡是导致土传病害发生的主要原因[2]，但至今在生产上仍缺乏高效、安全和规模化应用推广的棉花黄萎病防控技术[3]。秸秆处理是当前农业和环境面临的巨大挑战，仍存在利用率低、转化率低、经济效益低和环境污染严重等问题[4-5]。棉秆就地粉碎还田是目前棉秆利用的主要方式，但棉秆腐解速度缓慢，且带病菌棉秆长期还田将导致棉田黄萎病加重，棉秆分解产生的化感物质在土壤中积累的自毒效应也进一步加重了连作障碍[6]，这些都影响新疆棉花产业健康可持续发展。【前人研究进展】作物秸秆热裂解产生的生物质炭，为一种包含固体稳定性炭质和部分可溶性有机物并包含一定量矿质灰分(包括含有H、O、N、和S等元素)的多种组分混合的有机质[7]。稳定的炭质、良好的孔性及高的阳离子交换量是生物炭区别于其他化学肥料和秸秆有机肥的突出特点，具有显著改善土壤功能和促进土壤生态系统服务的作用[8-10]。近年来，生物炭对土传病害防控研究的报道也逐渐增多。生物炭能增加土壤微生物多样性[11-12]，增强有益微生物(拮抗菌、促生菌和腐生菌等)的数量和活性[13]，与病原菌在营养竞争中占优势，进而增加土壤生态系统的稳定性和抑病性[14]。真菌是土壤微生物的重要组成，直接影响土壤有机质循环、养分转化、毒物降解和作物病害发生等。陈坤等研究表明，施用生物炭利于真菌的积累[11]。曹辉等[15]在土壤施入0.5%～4%的炭化苹果枝对真菌类群组成没有明显影响。Solaiman等[16]发现生物炭能促进真菌与根系共生以及真菌菌根的生长。同时，生物炭可促进植物根系生长和养分吸收，使植物健康生长，增强植物对病害的抗性[17-18]。此外也有报道称由于生物炭具有较强吸附性，可吸附根系分泌的自毒物质，且多孔的结构影响病原菌的活动[19-20]，进而减轻土传病害的发生。【本研究切入点】采用秸秆生物质炭化还田调控土壤微生态环境，预防控制土传病害蔓延已成为科研工作者关注的新方向。但目前尚未有关于棉秆炭防控棉花黄萎病的研究报道。研究施用棉秆炭连作棉花根际土壤真菌群落多样性与土壤理化性质及黄萎病病害的关系。【拟解决的关键问题】通过2年的定位试验，研究施用棉秆炭棉花根际土壤真菌多样性、病原菌数量和土壤理化性状及棉花黄萎病防控效果的关系，分析棉秆炭对棉花黄萎病的防控效果及对土壤健康的修复作用机理，为研究棉秆炭在棉花生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验在新疆石河子农业科学研究院连作棉田中进行。该试验田地处44°20'N、86°03'E，属典型温带大陆性气候。棉花为覆膜滴灌栽培模式，土壤为灌耕灰漠土。土壤基本理化性质为有机碳12.50 g/kg，速效氮28.31 mg/kg，速效磷12.45 mg/kg，速效钾286.37 mg/kg，pH 8.32，电导率0.20 ms/cm。

棉秆炭由新疆农业科学院土壤肥料与农业节水研究所提供，其基本理化性质为有机碳771.80 g/kg，全氮15.72 g/kg，全磷15.31 g/kg，全钾25.04 g/kg，pH 10.27，电导率4.38 ms/cm。热解温度400～700 ℃，裂解时间1～2 h。将棉秆炭磨碎并通过2 mm筛。试验设4个处理：NPK：常规化肥+棉秆移除；NPKS：常规化肥+棉秆全量粉碎耕层混匀还田；NPKB1：常规化肥+棉秆移除+常量棉秆炭(施用量22.50 t/hm2，为耕层土质量的1%)；NPKB2：常规化肥+棉秆移除+增量棉秆炭(施用量45.00 t/hm2，为耕层土质量的2 %)。每个处理3次重复，随机排列。棉花播种前划分小区，第1年将棉秆炭一次撒匀后人工翻地，在20 cm深度内混匀，第2年不再补施。试验处理水肥管理相同，基肥为磷酸二铵75 kg/hm2和尿素225 kg/hm2播种前地表撒施翻耕；生育期随水滴肥7～8次，每次滴水120～180 m3/hm2，每次随水滴施尿素60～120 kg/hm2。

1.2 方 法

1.2.1 土样采集

采用5点法采集第2年不同处理棉花根际土壤。根际土壤采用抖土法采集，挖取0～20 cm土层棉花完整根系，并除去根围附近较大的土壤团块，轻轻抖下棉花根表面的土壤作为根际土壤。将样品混匀后分成2份，一份风干过筛后用于测定土壤理化性质，另外一份于-70℃保存，进行DNA提取，采用高通量测序方法对不同处理土壤中真菌的种类和数量进行分析。

1.2.2 土壤真菌群落结构多样性

采用CTAB方法对样本的基因组DNA提取、PCR扩增、纯化后，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行454-高通量测序。通过Illumina MiSeq平台，利用ITS1：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 和ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′ 为引物，进行高通量测序。测序结束后，对原始序列进行数据拆分、PE Reads拼接、Tags过滤和Tags去嵌合体序列后得到最终的有效序列。然后基于有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

1.2.3 土壤理化性质测定

采集的土壤样品，自然风干后，按照常规方法进行土壤pH值、电导率和养分的测定[21]。有机质测定采用重铬酸钾容量法，速效氮测定采用碱解扩散法，速效磷测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，速效钾测定采用醋酸铵浸提-火焰光度法，pH值测定采用电位法，电导率采用水浸提法。

1.2.4 棉花黄萎病病害调查及病原菌数量统计

棉花黄萎病发生的分级标准[22]：

0级：棉株健康，无病叶，生长正常；1级：1/4以下叶片发病，变黄萎蔫，茎部维管束变淡褐色；2级：1/4～1/2以下叶片发病，变黄萎蔫，茎部维管束变淡褐色；3级：1/2～3/4叶片发病，变黄萎蔫，茎部维管束变淡褐色；4级：棉株3/4以上至所有叶片发病，或叶片大部脱落，棉株枯死。

调查结果的统计：根据调查的结果计算各处理的发病率和病情指数。

发病率(Incidence of disease)=(发病总株数/调查总株数)×100%。

病情指数(Disease index)=[(Σ级数×每级的病株数)/(调查总株数×最高级代表值)]×100%。

大丽轮枝菌数量由高通量测序结果获得。

1.3 数据处理

高通量测序多样性指数计算公式如下：

(1)

(2)

SACE=

(3)

采用DPS 9.50软件对所得数据进行分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)、最小显著差数法(LSD)进行多重比较差异显著性检验(α=0.05)。随机选取相似度在97%条件下的OTU生成稀释曲线，并利用软件Mothur 计算丰富度指数Chao 和ACE，多样性指数Shannon。利用Excel 和R语言工具对样品物种组成及相对丰度统计结果绘制柱状图和热图。

2 结果与分析

2.1 棉秆炭对连作棉花根际土壤真菌多样性的影响

2.1.1 棉花根际土壤真菌群落的测序结果及多样性指数

研究表明，棉秆直接还田和炭化后还田对连作棉田土壤真菌群落多样性有显著影响。与NPK处理相比，NPKS处理降低了OTU的丰度，降幅为15.63%；炭化还田中NPKB1处理增加了真菌OTU的丰度，而NPKB2处理则显著降低了46.25%(P<0.05)。棉秆直接还田和炭化还田对土壤真菌数量均有一定的降低作用，其中增量棉秆炭的作用很显著。与NPK处理相比，真菌Shannon多样性指数NPKS和NPKB2处理分别显著降低了11.81%和65.40%，而NPKB1则增加了9.99%。棉秆直接还田和炭化还田均降低了ACE和Chao1指数。NPKS和NPKB2处理ACE指数分别降低了13.75%和28.39%，Chao1指数分别降低了13.99%和31.45%，NPKB1处理两个指数降幅均不显著。棉秆直接还田和增量棉秆炭能显著降低连作棉田土壤真菌多样性。表1

2.1.2 棉花根际土壤真菌在门水平的相对丰度

在微生物分类门的水平上，各处理土壤真菌群落种类上差异也不大，但不同处理间各物种的相对丰度之间有差异。与NPK处理相比，棉秆直接还田和炭化还田处理降低了土壤中担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)及其他一些地位不明确的真菌群落的数量；NPKS和NPKB1处理降低了子囊菌门(Ascomycota)数量，但NPKB2处理则显著增多；接合菌门(Zygomycota)真菌则表现出NPKB2下降幅度最大，其次是NPKS，NPKB1则显著升高。图1

表1 不同处理连作棉花根际土壤真菌群落多样性
Table 1 The diversity index of soil fungal communities difference treatments

TreatmentOTUShannon indexACE indexChao1 indexNPK480.00±10.15b4.83±0.05b533.59±12.13a527.11±19.17aNPKS405.00±18.72c4.26±0.13c460.24±15.95b453.36±20.32bNPKB1518.00±12.29a5.31±0.18a532.36±15.88a523.23±17.90aNPKB2258.00±22.61d1.67±0.16d382.09±16.16c361.33±11.49c

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05), 下同

Note： Different letters in the same column indicate significant difference atP< 0.05. The same as below

图1 不同处理土壤真菌在门水平的高通量相对丰度
Fig.1 High flux relative abundance of rhizosphere soils at phylum level different treatments

2.1.3 棉花根际土壤真菌在属水平的相对丰度和Heatmap热图

在微生物分类属水平上，不同处理土壤的前13种优势真菌菌群的丰度(OTU条数丰度大于1.0%)，合计占真菌总量的65.40%～96.45%，包括Penicillium、Tetracladium、Gibberella、Fusarium、Mortierella、Acremonium等及一些未鉴定出属的真菌类群。在这13种优势真菌中，Gibberella和Fusarium是常见的病原菌，NPK、NPKS、NPKB1和NPKB2处理Gibberella属分别占3.16%、2.24%、3.75%和0.58%，Fusarium属分别占2.88%、2.19%、3.16%和0.49%。而Acremonium属则产抑菌物质，四个处理分别占1.91%、1.27%、1.45%和2.69%，但没有增加Penicillium和Cortinarius等益生真菌的数量。图2

根据4个处理真菌的相对丰度特征，利用R语言绘制热图，并按照真菌相似度进行聚类。结果表明，在属水平上不同处理间差异显著，NPK处理和NPKB1处理真菌数量较多，有相似的真菌特征，聚为一类；NPKS处理真菌种类和数量其次，NPKB2处理最少，这2个处理真菌特征相似，聚为一类。图3

图2 不同处理土壤真菌在属水平的高通量相对丰度

Fig.2Highfluxrelativeabundanceoffungiindifferenttreatmentsatgenuslevel

图3 不同处理土壤真菌物种丰度聚类热
Fig.3 Cluster heat map of species abundance of fungi in different treatments

2.2 棉秆炭对连作棉田根际土壤理化性质影响

研究表明，棉秆炭化还田处理(NPKB)与棉秆直接粉碎还田处理(NPKS)之间土壤理化性质存在显著差异(P<0.05)。与单施化肥的对照处理(NPK)相比，NPKS处理连作棉田根际土壤有机质和速效钾含量差异不显著，速效钾含量反而呈下降趋势；而速效氮和速效磷含量显著升高，增幅分别为35.06%和143.76%；pH值和电导率差异不显著，但均呈下降趋势。棉秆炭处理显著增加了土壤有机质、速效钾的含量，NPKB1处理分别增加了30.59%和12.88%，NPKB2处理分别增加了85.88%和38.96%；速效氮含量NPKB1处理与NPK处理差异不显著，但NPKB2处理增幅显著，增加了59.09%；速效磷含量均呈下降趋势；pH值略有下降，但差异不明显。电导率显著升高，NPKB1处理和NPKB2处理分别升高了29.41%和70.59%。表1，表2

表2 不同棉秆炭化处理下连作棉田根际土壤理化性质变化
Table 2 Effect of cotton biochar on rhizosphere soil physical properties of continuous cropping cotton field

处理Treatment有机质OM(%)速效氮Available N(mg/kg)速效磷Available P(mg/kg)速效钾Available K(mg/kg)pH电导率EC(ms/cm)NPK1.70±0.04c38.50±1.06c8.73±0.11b242.30±3.52c7.86±0.01a0.17±0.02cNPKS1.81±0.02c52.00±0.70b21.28±0.41a238.71±4.07c7.84±0.01ba0.16±0.02cNPKB12.22±0.04b38.50±0.41c7.14±0.08d273.51±10.04b7.75±0.03b0.22±0.02bNPKB23.16±0.09a61.25±0.28a7.61±0.08c336.70±5.86a7.77±0.03b0.29±0.02a

2.3 棉秆炭对连作棉花土壤中黄萎病病原菌数量和发病率的影响

从高通量测序结果中大丽轮枝菌数量的结果可以看出，与NPK处理相比，在田间条件下，棉秆还田和常量棉秆炭增加了棉田土壤中大丽轮枝菌的数量，而增量棉秆炭病原菌数量则显著降低了63.83%。

棉花黄萎病发病率和病情指数的调查结果显示：与棉秆移除处理相比，棉秆还田和常量棉秆炭处理增加了棉花黄萎病的发病率和病情指数，常量棉秆炭的增加幅度更大一些，分别增加了8%和13.3%；而增量棉秆炭处理发病率和病情指数与棉秆移除处理差异不明显，但病情指数降低了2.2%。说明增量棉秆炭虽然没有降低棉花黄萎病的发病率，但有缓解病害发病程度的趋势。图4

图4 棉花根际土壤黄萎病病原菌数量、黄萎病发病率和病情指数
Fig.4 The number, disease incidence and disease index of Verticillium dahliae in different treatments

2.4 棉花根际土壤真菌群落多样性与土壤理化性质、黄萎病病害的相关性

对不同处理棉花根际土壤理化性质和真菌的OTU丰度大于1%的优势属进行冗余分析，两轴累计贡献率为82.62% 。研究表明，这4个处理中NPKB2分布于第1象限，NPKB1处理分布于第2象限，NPK处理和NPKS处理分布于第3象限，相距较近，说明施用棉秆炭对棉花根际土壤真菌群落组成有较大的影响。排列检验显示土壤理化性质中的AN和OM对棉花根际土壤真菌群落结构的影响最显著。图5

研究表明，秸秆直接还田和炭化后还田，根际土壤真菌多样性与理化性质和黄萎病发病之间关系密切。真菌的OTU、多样性指数与AN呈极显著负相关，与EC呈显著负相关；Shannon指数、Chao1 index与OM、Shannon指数与AK之间呈极显著负相关，OTU、ACE index与OM、OTU、ACE index、Chao1 index与AK呈显著负相关。黄萎病病情指数与OTU、Shannon指数呈显著正相关。黄萎病病原菌Verticillium数量与黄萎病发病率和病情指数呈极显著正相关。表3

图5 不同处理土壤真菌群落和土壤理化性质冗余
Fig.5 Redundancy analysis of fungal communities and soil physical and chemical properties in different treatments

表3 土壤真菌多样性与土壤理化性质及黄萎病病害相关系数
Table 3 Correlation coefficients between soil fungi diversity and soil physicochemical properties，Verticillium wilt

OMANAPAKpHECIncidence of diseaseDisease indexOTU-0.77∗-0.97∗∗-0.05-0.74∗0.17-0.67∗0.450.63∗Shannon index-0.84∗∗-0.93∗∗0.11-0.82∗∗0.25-0.76∗0.480.68∗ACE index-0.78∗-0.99∗∗-0.13-0.73∗0.24-0.66∗0.290.48Chao1 index-0.81∗∗-0.99∗∗-0.09-0.76∗0.28-0.69∗0.290.5Verticillium-0.61∗-0.69∗0.24-0.63∗-0.09-0.560.84∗∗0.95∗∗

3 讨 论

土壤微生物多样性对维持土壤健康和抑制植物病害非常重要[2]。已有研究表明，棉花长期连作能导致土壤微生物群落结构发生改变，各种土传病害滋生，而其中真菌型病害居多，有必要对连作棉花土壤真菌群落结构的变化进行研究。降低土壤中病原菌的数量，是防控土传病害的有效手段[23-24]。生物炭具有良好的保水保肥能力，对土壤微生物和植物生长产生了积极的影响，进而影响土壤病原菌生长繁殖以及对植物的侵染能力[17、25-27]。而秸秆还田由于将植株上的病原菌也直接还田，增加了土壤中病原菌的数量[28]。研究高通量测序的结果表明，与棉秆移除和棉秆直接还田相比，添加2%用量的棉秆炭能降低真菌OTU数量和多样性，这与Wang[29]研究结果一致。施用不同用量棉秆炭对连作棉花土壤中优势真菌种群子囊菌门和接合菌门数量的影响较大。子囊菌门真菌数量施用常量棉秆炭降低，增量棉秆炭则升高。接合菌门则表现出施用常量棉秆炭数量升高，而增量棉秆炭则降低。阎海涛等研究表明生物炭提高了子囊菌门和担子菌门的相对丰度，降低了接合菌门的相对丰度[30]。子囊菌门真菌与人类生活密切相关。有的能引起根腐、茎腐、果(穗)腐、枝枯和叶斑等植物病害，有的则可产生抗生素、有机酸、激素、维生素等有益于作物生长[31]。研究表明，施用棉秆炭没有增加子囊菌门中产抗生素的Penicillium属数量，但增量棉秆炭的施用降低了Gibberella和Fusarium属病原菌的数量。接合菌门真菌大多为腐生物，可用于食品发酵及酶和有机酸生产；有些接合菌门真菌与高等植物共生形成菌根；还有少数可以寄生植物、人和动物引起病害[32]。研究表明，棉秆炭能增加接合菌门中被孢霉科的数量，被孢霉科能分解土壤中的糖类和简单多糖物质是土壤有机质和养分含量丰富的标志[33]。多数研究表明，生物炭能促进菌根真菌生长[34]，但研究显示施用棉秆炭使产菌根真菌的接合菌门和球囊菌门真菌数量减少，这可能与生物炭使土壤中磷含量降低有关[35]，相关研究还需深入进行。

土壤理化性质与土壤微生物、作物病害关系密切。研究表明，增加土壤有机碳含量，提高养分含量能有效地改善土壤环境，减轻作物病害，增加产量[36]。生物炭一般含碳60%以上，输入后可增加土壤有机碳含量，且本身含有氮、氧、硫等多种养分元素和无机碳酸盐成分[16]。同时发达的孔隙结构赋予生物炭较强的吸附能力和较大的离子交换量，进而提高土壤的养分利用率和持水能力，进而对土壤健康和植物生长产生积极的影响[37-38]。研究表明，在棉秆炭施用第2年可显著增加土壤电导率、有机质、速效钾和速效氮的含量，更有利于改善土壤结构，提高连作棉花土壤中养分的含量。但速效磷含量呈下降趋势，可能生物炭中磷含量不高，另外，土壤pH值高可能增加了磷的固定，不利于有效磷的释放[39]。研究中pH值变化不明显，但呈下降趋势，这可能与灰漠土本身偏碱性，盐基饱和度较高，生物炭中可溶性的K、Ca、Na、Mg 等盐基离子不能显著提高灰漠土的盐基饱和度有关，且土壤的缓冲性能较好进而导致施用生物炭对灰漠土pH 的影响较小[40-41]。目前秸秆直接还田是常用的秸秆处理方式，因秸秆含有丰富的氮、磷、钾、钙、镁和有机等，秸秆直接还田也可以增加土壤养分，本研究NPKS处理除速效磷含量外，其余养分含量均低于棉秆炭处理。

相关性分析表明，真菌多样性与土壤理化性质关系密切[42]。棉秆炭对环境因子的改变，驱动了土壤真菌群落的生态演替，降低了真菌群落多样性，同时抑制了土传病原菌活性，进而降低了病害的侵染率。黄萎病病害的发生与土壤中大丽轮枝菌的数量呈极显著正相关性，这与刘海洋等[43]的研究结果一致。

但棉花黄萎病的发病程度除取决于根际和土体土壤中的病原菌数量及病原菌遗传变异程度和微生物区系等影响因素外，病原菌的分布、植株健康状况、环境因子，如土壤温度、湿度、养分状况、耕作制度和栽培管理条件等也与棉花黄萎病的发病程度有着密切的相关性。研究中，虽然施用棉秆炭棉花根际土壤真菌群落多样性和黄萎病病原菌的数量显著降低，但与棉秆移除相比黄萎病发病率的降低却并不明显，常量棉秆炭的发病率甚至上升，仅增量棉秆炭有降低病情指数的趋势。与目前农民常采取的棉秆直接粉碎还田方式相比，增量棉秆炭还是有一定的防控效果。同时棉秆炭对棉花黄萎病的防控，还取决于棉秆炭的添加量。大田的环境较复杂，棉秆炭对棉花土壤微生态环境的影响，对植株产生间接效应的研究还需加强。

4 结 论

4.1 与棉秆移除和棉秆直接还田相比，施用棉秆炭连作棉花根际土壤真菌多样性和理化性质有显著相关性。增量棉秆炭处理降低了根际土壤真菌多样性，不同用量棉秆炭对子囊菌门和接合菌门真菌数量的影响较大，但菌根真菌数量降低。常量棉秆炭处理与单施化肥处理有相似的真菌群落特征，增量棉秆炭与棉秆直接还田的真菌群落特征相似。RDA 分析中，土壤理化性质影响着土壤真菌群落结构，尤其是土壤的OM和AN含量是重要环境因素。

4.2 施用棉秆炭降低了棉花黄萎病病原菌数量，与NPK处理相比，增量棉秆炭Verticillium数量显著降低了63.83%。与NPK处理和NPKS处理相比，NPKB1处理增加了黄萎病病害发病率和病情指数，而NPKB2处理黄萎病病害发病率下降不显著，病情指数分别降低了2.2%和15.0%。棉秆炭化还田没有显著降低棉花黄萎病的发病率，但有缓解病害发病程度的趋势。