棉花黄萎病拮抗细菌胞外酶检测及其酶活测定

李雪艳，张涛，杨红梅，楚敏，高雁，曾军，霍向东，张涛，林青，欧提库尔，李玉国，娄恺，史应武

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究目的】棉花是新疆主要经济作物，随着棉花种植区的连年轮作，黄萎病日益严重，对棉花的产量和质量损害巨大。大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)是棉花黄萎病的主要致病菌，该真菌类型多、变异快、菌系与寄主关系复杂[1,2]。防治这种土传病害通常使用化学杀菌剂、高抗育种、生物防治等方法，化学杀菌剂只能治标不治本，对土壤中的致病孢子作用小，而且污染环境；高抗育种年限长且适应新疆棉田的高抗棉株品种少、安全的防控土传疾病，而且不会影响其他农业系统的有益微生物[3,4]，符合绿色可持续发展的理念。研究发现，真菌[5]、细菌[6,7]、放线菌[8]等部分微生物可降低棉花黄萎病发病率，生防机理主要有营养与生态位的竞争，拮抗物质，诱导植物抗病性等[9]，抗菌物质中各种酶类起到关键作用。真菌细胞壁的主要成分有几丁质、葡聚糖、纤维素、蛋白等，研究4株拮抗菌产几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶可一定程度解释真菌细胞肿胀和细胞壁完整性缺失，导致细胞的裂解和死亡的原因[10]，为进一步开发应用该4株拮抗菌株提供依据，为4株拮抗细菌的防治机理研究奠定基础。【前人研究进展】国内外目前已有关于微生物胞外酶防治病害的报道，苏明慧等[11]发现从芽孢杆菌FM4B分离的几丁质酶可抑制西瓜枯萎病菌，酶液浓度越高抑制效果越好；田亚琴等[12]发现几丁质酶、葡聚糖酶与芒果炭疽菌抑制效果相关；Li等[13]发现几丁质酶、葡聚糖酶能水解植物病原菌细胞壁从而抑制病原真菌；文凤云等[14]发现葡聚糖酶是多粘类芽孢杆菌CP7拮抗真菌活性组分或其中之一，并克隆葡聚糖酶基因构建高效表达菌。刘艳[5]报道哈茨木霉4种离体蛋白酶对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、核盘菌、链格孢菌和杨树烂皮病菌有不同程度的抑制作用。【本研究切入点】目前棉花黄萎病防治效果不理想。已通过电镜扫描验证4株拮抗细菌均可破坏大丽轮枝菌细胞形态，但其拮抗机理尚不明确。研究棉花黄萎病拮抗细菌胞外酶检测及其酶活测定。【拟解决的关键问题】通过检测培养基，透明圈法测定胞外酶的种类，经酶类发酵培养基富集，DNS法测定纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶活，福林-酚法测定蛋白酶活。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种来源

BHZ-29、SHZ-24菌株由实验室分别从博乐、石河子棉株体内筛选；SHT-15、SMT-24均从石河子棉株种植根际土壤中分离所得。

1.1.2 种子液培养基

NB培养基。

1.1.3 鉴别培养基

葡聚糖鉴别培养基：参考文献[15]；纤维素酶检测培养基：CMC-Na 1 g，(NH4)2SO40.4 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.05 g，GaCl20.002 g，蛋白胨0.1 g，酵母膏0.1 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，pH中性，0.1%刚果红备用；蛋白酶检测培养基：参考文献[10]海水更改为蒸馏水；胶体几丁质酶检测培养基：参考文献[16]。

1.1.4 发酵培养基

纤维素酶发酵培养基：不加琼脂的纤维素检测培养基，pH中性；葡聚糖酶发酵培养基：无琼脂及染料的葡聚糖检测培养基，酵母膏2 g，pH中性；胶体几丁质酶发酵培养基：胶体几丁质0.2 g，酵母膏0.6 g，K2HPO40.1 g，KH2PO40.15 g，GaCl2·2H2O 0.1 g，MgSO40.02 g，蒸馏水100 mL，pH中性；蛋白酶发酵培养基：可溶性淀粉1 g，蛋白胨0.5 g，Na2HPO4·12H2O 0.4 g，KH2PO40.03 g ，GaCl20.1 g，蒸馏水100 mL，pH中性。

1.1.5 主要试剂

胶体几丁质参考[17,18]自制，3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂参考[17]配制，0.1 mol/L pH值为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、0.02 mol/L pH值为7.5的磷酸缓冲液均参考文献[18]配制，其余均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌种子液的制备

将NA上划线分离的拮抗菌单菌落接种到NB液体培养基，30℃、200 r/min振荡发酵1 d。

1.2.2 粗酶液的制备

将4种拮抗菌的种子液按照分别按照4%的量接种到葡聚糖酶、纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶发酵培养基中，500 mL三角瓶装液量为50 mL，葡聚糖酶、纤维素酶发酵培养基30℃、200 r/min振荡培养12、36、60、84和108 h，几丁质酶、蛋白酶同条件下发酵培养12、36、60、84、108和132 h。10 000 r/min离心15 min，取上清液备用。

1.2.3 拮抗菌产几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶平板检测

分别在葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶检测培养基上打5孔(直径6 mm)，四周呈正方形对称打4孔为处理组，每孔加拮抗菌种子液100 μL，培养基中心孔为对照组，加100 μL无菌NB培养基，放置30℃恒温培养箱培养48 h，将葡聚糖检测培养基与纤维素检测培养基用0.1%的刚果红溶液10～15 mL染色20 min，倾倒染液后加入1 mol/L的NaCl至满平板，静置20 min，反复NaCl洗3次，测量记录透明圈外径大小。

1.2.4 标准曲线的建立

称取适量无水葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、L-酪氨酸放置于105℃烘箱内干燥至恒重，分别准确称取 1.000 g，配制成1 mg/mL的葡萄糖标准液，1 mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖标准液，0.1 mg/mL的L-酪氨酸标准液。

葡萄糖标准曲线的建立参考文献[19]稍作修改，葡萄糖标准液加入量改为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，DNS溶液加入量更改为3.0 mL，蒸馏水定容至10 mL。N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的建立同上，将葡萄糖标准液更改为N-乙酰氨基葡萄糖标准液，加入量为0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 mL，补充蒸馏水至1.5 mL，DNS加入量1.5 mL，最终定容体积为7.5 mL。L-酪氨酸标准曲线建立参考文献[20]。

1.2.5 拮抗菌几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶活测定

0.5%CMC-Na 、1%葡聚糖、0.5%胶体几丁质用0.1 mol/L pH为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液配制,0.5%的酪素用0.02 mol/L pH为7.5的磷酸缓冲液配制。采用DNS法测定葡聚糖、纤维素、几丁质酶活性，在540 nm波长处记录样品OD值；采用福林-酚法测定蛋白酶活性，在680 nm波长处记录OD值，均以灭活粗酶液为对照组。分别将样品细菌计数，稀释105、106、107梯度涂布，每个梯度3个平行试验。

1.2.5.1 纤维素酶活性测定

1 mL 0.5%CMC-Na与1 mL纤维素粗酶液混合50℃水浴30 min，加3 mL DNS，100℃煮沸5 min，冷却补充体积至10 mL。

1.2.5.2 葡聚糖酶活性测定

1 mL 1%葡聚糖与1 mL葡聚糖粗酶液，混合50℃水浴30 min，加3 mL DNS，100℃煮沸5 min，冷却补充体积至10 mL。

1.2.5.3 几丁质酶活测定

参考文献[17]稍作修改，1 mL 0.5%胶体几丁质与1 mL几丁质粗酶液50℃水浴30 min，10 000 r/min离心15 min，取离心上清液1.5 mL与1.5 mL DNS溶液沸水浴5 min，冷却后定容7.5 mL。

1.2.5.4 蛋白酶活性测定

参考文献[20]稍作修改，1 mL蛋白质粗酶液与1 mL 0.5%的酪素混合，37℃水浴20 min，加1 mL三氯乙酸终止反应，10 000 r/min离心15 min后取上清液0.5 mL补充蒸馏水0.5 mL，加0.55 mol/L的碳酸钠溶液5 mL，最后加福林酚溶液1 mL，37℃水浴显色20 min。

1.2.6 酶活定义

底物在一定反应条件下(葡聚糖、几丁质、纤维素50℃下水浴30 min，酪蛋白37℃水浴20 min)与粗酶液反应30 min生成1 μg葡萄糖/酪氨酸为一个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 平板透明圈法测定SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24几种胞外酶

研究表明，BHZ-29、SHT-15、SMT-24菌株均产葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶，不产几丁质酶；SHZ-24产几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶，不产纤维素酶。检测平板上蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶解圈清晰透明，边缘界限明显，葡聚糖酶解透明圈菌株SHZ-24、SHT-15清晰，BHZ-29、SMT-24边缘模糊，界限不清。图1

研究表明，SHZ-24菌株几丁质酶解圈与其他处理组间差异显著，酶解外径为(14.85±0.15) mm。蛋白酶透明圈外径大小均与对照组差异极显著，SHZ-24菌株蛋白酶解圈最大，达(28.85±0.37) mm；葡聚糖酶解圈外径大小组间差异均显著，SMT-24菌株葡聚糖酶解圈最大，达(36.50±0.36) mm。BHZ-29、SMT-24、SHT-15菌株之间纤维素酶透明圈外径大小对照组差异显著，最大为(17.50±0.42) mm。表1

注：1～4分别代表SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24，CK为空白对照

Note： 1-4 respectively represent SMT-24, BHZ-29, SHT-15, shz-24,CK as blank control

图1 平板透明圈法初测结果

Fig.1InitialtestresultsofPlatecultureandclearzonesmethods

表1 酶解透明圈外径及方差
Table 1 Analysis of size and variance of enzymatic transparent circles

酶解圈外径 Enzyme solution outside diameter (mm)几丁质酶Chitinase蛋白酶Protease葡聚糖酶Glucanase纤维素酶CellulaseSMT-246.00±0b27.78±0.71b36.50±0.36a16.33±0.51aBHZ-296.00±0b27.10±0.34b32.09±0.13b17.50±0.42aSHT-156.00±0b25.45±0.34c29.53±0.33c16.68±0.30aSHZ-2414.85±0.15a28.85±0.37a24.03±0.27d6.00±0b对照 Control6.00±0b6.00±0d6.00±0e6.00±0b

注：不同的字母代表同一种酶不同菌种间的差异显著(P<0.05)

Note： Different letters represent a significant difference between different strains of the same enzyme (P<0.05)

2.2 标准曲线建立

葡萄糖标准曲线、N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线、L-酪氨酸标准曲线对应线性方程分别为y1=13.289x1-0.115 6、y2=11.111x2-0.130 3、y3=0.070 6x3-0.002，相关性系数分别为0.998 6、0.998 9、0.999，线性关系良好。

2.3 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24拮抗菌株产几丁质酶活性测定

研究表明，SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株数量在0～132 h内出现先快速增加后减小，最后趋于稳定。SMT-24、BHZ-29、SHT-15菌株几丁质酶活均低于3.00 IU表明该三株菌产几丁质酶低或不产几丁质酶，酶活0～132 h内无变化，酶活不受生物量的影响。SHZ-24酶活0～36 h几丁质酶活呈现指数型增长，36～108 h增长缓慢，108 h达到最大值(12.37±0.15) IU，108～132 h呈现下降趋势，细菌对数期与酶活呈正相关。图2

注：A～D分别是菌株SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24几丁质酶活变化

Note： A-D are chitinase activity changes of strains SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24, respectively

图2 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24拮抗菌株几丁质酶活变化
Fig.2 Results of chitinase activity change of SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24 antagonistic strains

2.4 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24拮抗菌株蛋白酶活测定

研究表明，SMT-24、BHZ-29、ShT-15、SHZ-24菌株细菌数量在0～36 h逐渐增加，36 h后细菌数量先下降最终维持稳定。SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24蛋白酶活在0～12 h迅速增加，随后缓慢增加，SMT-24、BHZ-29、SHZ-24菌株在84 h蛋白酶活达到最大值分别为(21.21±0.54) IU、(8.65±0.35) IU、(24.22±0.45) IU，SHT-15菌株在108 h蛋白酶活达到最大值(17.78±0.21) IU，84 h后SMT-24、BHZ-29、SHZ-24蛋白酶活缓慢下降，SHT-15酶活达到稳定状态。蛋白酶活受对数期生长的细菌的影响最大，呈正相关。图3

注：A～D分别是菌株SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24蛋白酶活变化

Note： A-D are protease activity changes of strains SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24, respectively

图3 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24拮抗菌株蛋白质酶活变化
Fig.3 Results of protease activity changes of SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24 antagonistic strains

2.5 SMT-24、BHZ-29、SMT-15、SHZ-24拮抗菌株葡聚糖酶活测定

研究表明，SMT-24、BHZ-29菌株细菌数量出现先迅速上升后下降，最终维持细菌数稳定，SHT-15、SHZ-24菌株细菌数量先上升后维持稳定。SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株葡聚糖酶活整体呈现先增加后下降的趋势，SMT-24、SHT-15、SHZ-24菌株葡聚糖酶活在上升阶段增长较快，BHZ-29菌株酶活在上升阶段0～12 h增长快速随后缓慢增加，SMT-24、BHZ-29菌株葡聚糖酶在84 h达到最大值，分别为(12.29±0.23) IU、(9.16±0.46) IU，SHT-15菌株葡聚糖酶活在60 h达到最大值(12.07±0.59) IU，SHZ-24菌株在36 h葡聚糖酶活达到最大值(8.12±0.25) IU。SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株在0～12 h菌株生物量与酶活呈正相关发展趋势。图4

注：A～D分别是菌株SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24葡聚糖酶活变化

Note： A-D are glucanase activity changes of strains SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24, respectively

图4 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株葡聚糖酶活变化
Fig.4 Results of glucanease activity changes of SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24 antagonistic strains

2.6 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株纤维素酶活性测定

研究表明，BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株在纤维酶发酵培养基中培养60 h达到最大，生长期较长。SMT-24菌株细菌数量60 h后下降，SMT-24、SHZ-24菌株数量60 h后均维持稳定。SMT-24菌株生长缓慢，0～36 h增长幅度较小,30～108 h先下降后达到稳定，稳定后的细菌数量低于接种量。SMT-24、BHZ-29、SHT-15菌株纤维素酶活在0～84 h为上升阶段，84 h达到最大值，分别为(6.43±0.24) IU、(5.80±0.12) IU、(4.81±0.04) IU，84～108 h纤维素酶活下降，SHZ-24菌株纤维素酶活低于3.00 IU，且0～108 h酶活性无变化，SHZ-24菌株不产纤维素酶或者产纤维素酶较低。SMT-24、BHZ-29、SHT-15菌株纤维素酶活受细菌对数期影响较大，呈正相关。SHZ-24菌株纤维素酶活性不受生物量影响。图5

注：A～D分别是菌株SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24纤维素酶活与生物量变化

Note： A-D are activity cellulase changes of strains SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24, respectively

图5 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株纤维素酶活变化
Fig.5 Results of cellulase activity changes of SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24 antagonistic strains

2.7 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株酶活大小比较

研究表明，SHZ-24菌株几丁质酶活最大，SMT-24、BHZ-29、SHT-15酶活曲线重合，表明该三株菌几丁质酶活大小相同。SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株蛋白酶活大小为：SHZ-24> SMT-24> SHT-15> BHZ-29。葡聚糖酶活整体SMT-24、SHT-15菌株较大，BHZ-29菌株次之，SHZ-24菌株葡聚糖酶活最小。纤维素酶活大小比较为SMT-24> BHZ-29> SHT-15> SHZ-24菌株。图6

注：A～D分别代表几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶

Note： A-D represent chitinase, protease, glucanase and cellulase, respectively

图6 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株酶活大小比较
Fig.6 Comparing the Enzyme Activity of SMT-24, BHZ-29, SHT-15 and SHZ-24

3 讨 论

根据测定与DNS法酶活测定结果，蛋白酶、纤维素酶活、葡聚糖酶活与平板的透明圈外径大小不一致，表明透明圈外径大小与液体样品的酶活之间的正相关关系并不是绝对的，仅以透明圈径大小作为菌株产酶能力的唯一定量指标并不可靠，这在蒋明星、包衎等[21,22]的研究中也出现类似情况。可能原因是酶活受培养基状态的影响，细菌在固体平板生长分泌的酶活与在发酵液中生长产酶活性存在差异，另外蛋白酶固体平板中营养成分与液体发酵培养基的成分不同也是造成酶活差异的原因之一。细菌在衰退期时随着发酵时间延长酶活有不同程度的降低，这可能是随着发酵时间的延长，代谢物积累，细胞凋亡，发酵液pH降低，从而降低酶活。4株拮抗菌产酶类丰富，蛋白酶在饲料、皮革、食品方面应用广泛[23]，4株拮抗菌均可作为产蛋白酶来源菌株及其他产酶来源菌株。

4 结 论

SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24菌株均分泌几丁质酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶；在发酵期间酶活总体呈现先增加后减小的趋势，酶活性受细菌对数期影响最大，酶活性与拮抗细菌对数期呈正相关关系(酶活低于3.00 IU除外)；4株拮抗菌酶活比较中，SHZ-24菌株产几丁质酶活最高，酶活最高为(12.37±0.15) IU，SHZ-24菌株产蛋白酶活最高，最高值达(24.22±0.45) IU，SMT-24、SHT-15菌株产葡聚糖酶活较高，最高酶活分别(12.29±0.23) IU、(12.07±0.59) IU，SMT-24菌株产纤维素酶活最高，酶活最高达(6.43±0.24) IU。