5个野生云耳菌株生物学特性的研究

2018-12-11王灿琴韦仕岩吴圣进陈雪凤蓝桃菊吴小建

西南农业学报 2018年11期

王灿琴，韦仕岩，吴圣进，陈雪凤，蓝桃菊，吴小建

(广西农业科学院微生物研究所，广西南宁 530007)

【研究意义】黑木耳 Auricularia auricula-judae(Bull.)Qué［1］，又名红木耳、光木耳、云耳、木耳菇、川耳、黑菜等［2］，是我国三大食用菌栽培品种之一，其年产量仅次于平菇和香菇［3］。黑木耳是一种珍稀的食、药兼用食用菌品种［4］，深受人们的喜爱，具有广阔的市场前景。广西的黑木耳因其独特的口感及上好的品质统称云耳，是本土唯一的名特优食用菌品种［5］，但长期以来广西本土的云耳产品都是以野生采摘为主，野生云耳资源逐年锐减，甚至濒临灭绝。进行野生云耳生物学特性研究，对广西野生云耳种质资源的有效保护和优异种质的发掘及创新利用具有重要意义。【前人研究进展】近年来，国内对野生黑木耳的研究报道以优良菌株的筛选为主。亢学平等［6］从6个野生黑木耳菌株中筛选出3个综合性状表现优良的菌株;吕玉珍等［7］也选育出一个优良的野生黑木耳菌株。对广西本土野生云耳的相关研究报道比较多。黄艳芳等［8］对广西野生黑木耳种质源进行了调查，发现广西野生黑木耳集中发生在桂西、桂西北具有成片栎林的地域;王灿琴等［9］从5个野生云耳菌株中筛选出2个综合性状表现较好的菌株;李发盛等［10－11］从野生云耳中分离驯化获得一株性能稳定的优良菌株，并对其生物学特性进行了研究。【本研究切入点】广西野生云耳种质资源丰富多样，发生季节、地理位置等不同使得其品种的特性各异。目前仅有李发盛等［11］对驯化成功‘百云6号’菌株的生物学特性进行了研究报道。王灿琴等［9］虽然筛选出2个产量和品质较好的菌株，但未对其生物学特性进行研究。而广西还有很多丰富的野生云耳种质资源尚待挖掘利用。【拟解决的关键问题】从广西各地收集到一批野生云耳菌株，通过野生分离及驯化栽培，从中选出产量、品质均表现较好的5个菌株进行生物特性的研究，为其品种筛选及栽培试验提供理论依据，同时为野生云耳种质资源创新利用奠定重要基础。

表1 供试菌株来源及农艺性状Table 1 Origins and economical characters of tested strains/varieties

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株来源及农艺性状见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 碳源试验用马铃薯200 g、琼脂20 g，硫酸镁2 g、磷酸二氢钾2 g，作为基础培养基，分别加入葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、淀粉各20 g，定容至1000 mL，pH自然，制成不同碳源的培养基，并倒入规格为9 cm的平皿。将各供试菌株接种于平皿后置于30℃恒温培养箱内培养7 d，每个处理3个重复，观察记录各处理的菌丝生长情况。

1.2.2 氮源试验用马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，硫酸镁2 g、磷酸二氢钾2 g，作为基础培养基，分别加入酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾各3 g，定溶至1000 mL，pH自然，制成不同氮源的培养基，并倒入规格为9 cm的平皿。将各供试菌株接种于平皿后置于30℃恒温培养箱内培养7 d，每个处理3个重复，观察记录各处理的菌丝生长情况。

1.2.3 温度试验将各供试菌株分别接种于平板(规格9 cm)培养基上，(培养基配方:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，硫酸镁2 g、磷酸二氢钾2 g，定溶1000 mL，pH自然)，接种后先置于30℃培养箱培养2 d，等菌丝萌动后分别置于15、20、25、30和35℃下培养，每个处理3个重复，培养7 d后观测菌落日平均生长速度，并进行比较分析。

1.2.4 pH试验 PDA培养基灭菌前，先用HCl溶液和 NaOH 溶液分别调至 pH 4、5、6、7、8、9、10 和11，并制成平板，平皿规格为9 cm。将各供试菌株分别接种于不同pH的培养基上，每个处理重复3次，接种后置于30℃的恒温培养箱中培养7 d。观测菌落日平均生长速度，并进行比较分析。

1.2.5 水分试验将杂木屑、棉籽壳和麦麸在50℃下烘8 h，自然冷却后备用。配制6份配方为:杂木屑65%、棉籽壳20%、麦麸12%、石膏粉1%、过磷酸钙1%、石灰1%的培养基。将培养基的含水量分别调至50%、55%、60%、65%、70%、75%，共6个处理。调节好含水量后将培养料装入规格为:5 mm×200 mm的试管中，高压灭菌2 h，冷却后将各供试菌株分别接种于培养基中，每个处理3个重复。并置于30℃培养箱内培养10 d，观察记录各处理的菌丝日平均生长速度。

1.2.6 抗霉性试验将大小一致，并经纯化培养过的7个供试菌株分别和青霉菌菌种一起接种在同一PDA平板培养基的两边，让供试菌株和青霉菌进行对峙培养，每个处理3个重复，并置于30℃恒温箱培养内培养7 d。观察各菌株的抗青霉菌效果。

1.3 测定项目及方法

观测、记录碳、氮素营养条件下各供试菌株的菌丝生长情况，包括菌丝的日平均生长速度和菌丝的生长势。其中菌丝日平均生长速度每隔4 d测量1次，取每次重复的平均值。菌丝生长速度(mm/d)=菌丝直线生长长度(mm)/菌丝生长天数(d);菌丝生长势即菌丝生长强弱，用“++++”表示菌丝洁白，浓密粗壮，整齐。“+++”表示菌丝较洁白，较浓密粗壮。“++”表示菌丝稀疏、细弱。“+”菌丝极稀疏、细弱且不整齐。

温度、水分及pH值酸碱性试验都是按照一定的梯度条件进行，用曲线图对菌丝的日平均生长速度进行比较分析。

1.4 统计分析

采用DPS v7.05软件对各菌株在碳、氮源营养条件下菌丝日平均生长速度的各组数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 碳、氮素营养条件下各供试菌株菌丝生长表现

从表2可以看出，7个供试菌株在不同的碳素营养中表现各异，其中以葡萄糖作为碳源时，各菌株的菌丝长速虽然较慢，但长势表现最好，均表现为洁白、浓密粗壮、整齐;蔗糖不适合作916和TY081的碳源，麦芽糖不适合作TY081的碳源，果糖不适合作为TY041、916和TY081的碳源;乳糖和淀粉作为碳源时，各供试菌株的菌丝生长均不理想，表现为菌丝生长速度较慢，且长势稀疏细弱、不整齐、活力差，因此，6个碳源中，乳糖和淀粉不适宜作为云耳的碳源。

在适宜生长的4个碳素培养基中，TY071菌株的菌丝除了在麦芽糖上长速较慢，在葡萄糖、蔗糖、果糖3个碳源上的日平均生长速度都是最快，与2个对照相比存在差异极显著水平，菌丝长势以在葡萄上的表现最佳;其次表现较好的是TY026菌株，该菌株的菌丝除了在蔗糖上的长速比HME2对照菌株较慢以外，在另外3个碳源上的长速都比2个对照菌株快，菌丝长势也表现良好;此外，TY081菌株在麦芽糖上不萌发。TY041菌株的菌丝在蔗糖上长速比两个对照菌株快，但在果糖上长势表现较差。YE1菌株的菌丝在葡萄糖上长速最慢，但在蔗糖上菌丝长速居第2位，且在4个适宜生长的碳源上菌丝长势均表现良好。

从表3可以看出，6个氮素营养中，各供试菌株的菌丝在酵母粉、牛肉膏、蛋白胨作为氮源的培养基上生长表现良好，这3种氮源可作为云耳的氮素营养。其中以酵母粉作为氮源的表现最好，其次是蛋白胨，最后是牛肉膏;各供试菌株在硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵作为氮源的培养基上菌丝表现不理想，特别是菌丝长势表现极差，因此，这3种氮源不适合作为云耳的氮素营养。

从各供试菌株在适宜生长的氮源表现来看，HME2对照品种的菌丝长速及长势表现最佳;其次TY071、TY026和TY041等3个菌株的菌丝生长表现较好。除了TY041在蛋白胨上的表现比另一对照菌株916稍差以外，其它均优于对照菌株916;其余2个菌株在适宜的氮素培养基上长速最慢，除了YE1在牛肉膏上的长势表现出菌丝稀疏、细弱、不整齐外，其它长势均表现较好。

2.2 不同温度条件对供试菌株菌丝长速的影响

从图1可看出，各供试菌株的菌丝在15～30℃的温度范围内长速和温度呈正比，温度达30℃时各菌株菌丝长速最快。温度达35℃时，除TY081菌株菌丝不能萌发外，其它菌株菌丝长速开始减慢;HME2、916，2个对照菌株在15～25℃范围内菌丝长速比较慢，但在25～30℃的温度范围内，其菌丝长速反超于其它菌株，由此看出2个对照菌株更耐高温。TY026、TY071，2个菌株的菌丝在15～25℃范围内长速快于对照菌株，25～35℃温度范围内被对照菌株反超，由此说明2个云耳菌株适应的温度范围略低于对照菌株;YE1、TY081，2个菌株在本试验中菌丝表现慢于其它菌株，特别是TY081菌株在35℃高温下菌丝不能萌发。

表2 不同碳源对供试菌株生长的影响Table 2 Effect of different carbon sources on mycelial growth of tested strains

表3 不同氮源对供试菌株生长的影响Table 3 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of tested strains

2.3 不同含水量对供试菌株菌丝长速的影响

从图2 可知，TY026、YE1、HME2，3 个菌株在 70%的水份含量菌丝长速达到最高值;TY041、TY071、TY081、916，4个菌株在65%的水份含量菌丝长速达到最高值。由此可见几个供试菌株的最适宜含水量在65%～70%。从各菌株的菌丝在不同水份含量的长速表现来看，TY041、TY071、TY026，3 个菌株和HME2对照菌株的菌丝长速基本上接近，且明显快于916对照菌株;YE1和916对照菌株的菌丝长速基本接近，而TY081菌株则明显慢于其它菌株。

2.4 不同酸碱性对供试菌株菌丝长速的影响

图1 不同温度对供试菌株菌丝长速的影响ig.1 Effect of different temperature on mycelial growth of tested strain

从图3可以看出，各供试菌株的菌丝在pH 4～11的范围内都可以生长。其中 TY041、TY071、TY081、916，4个菌株的菌丝在pH 8的碱性条件下长速最快;TY026、HME2、YE1，3个菌株的菌丝在pH 9的碱性条件下长速最快。因此，各供试菌株的菌丝生长最佳酸碱度范围是pH 8～9。从各菌株的表现来看，TY071和TY026跟HME2对照菌株的长速很接近，且明显快于916对照菌株;TY041和YE1虽然比HME2对照菌株慢，但明显快于916对照菌株;TY081菌株是所有菌株中长得最慢的。

2.5 供试菌株抗青霉菌试验表现

图2 不同含水量对供试菌株菌丝长速的影响Fig.2 Effect of different moisture on mycelial growth of tested strains

图3 不同酸碱度对供试菌株菌丝长速的影响Fig.3 Effect of different pH on mycelial growth of tested strains

图4 供试菌株抗青霉菌试验表现Fig.4 The antimicrobial activities of tested strains/varieties to Penicillium sp.

从图4可以看出，TY081、TY026，2个菌株在跟青霉菌对峙生长的时候，其菌落面积最大，甚至在形成对峙线后还有部分菌丝可以盖过青霉菌继续生长，因此，这2个菌株的抗青霉菌能力最强;其次916、HME2、TY071 和 YE1，4 个菌株的菌落面积虽然较小，但形成对峙线后仍可以盖过青霉菌继续生长，因此，这4个菌株的抗青霉菌能力也较强;抗青霉菌能力最差的是TY041，在跟青霉菌对峙生长过程中，菌落面积小且不能盖过青霉菌继续生长。

3 讨论

各供试菌株的菌丝在不同碳、氮源培养基上表现各异，在以葡萄糖作为碳源的培养基上，各供试菌株的菌丝长速虽然不是最快，但菌丝长势表现最佳。以麦芽糖、果糖作为碳源时各菌株菌丝长速最快，但菌丝长势表现一般;酵母粉是各供试菌株的最佳氮源，其次是蛋白胨。赵梓楠［12］和李发盛等［11］用同样的碳、氮源分别对5个黑木耳和‘百云6号’云耳菌株的菌丝长速进行分析，结果与本研究基本一致，即5个黑木耳菌株的菌丝在葡萄糖上表现最好，‘百云6号’云耳菌株在酵母粉上生长最快。由此可知，葡萄糖和酵母粉是黑木耳和野生云耳的最佳碳、氮源;赵梓楠［12］的研究表明5个黑木耳的最佳温度在25 ℃左右，李发盛等［11］和郭砚翠等［13］分别研究得出:‘百云6号’和黑木耳8808菌株的最适温度为25～30℃。本研究表明各供试菌株的菌丝在25～30℃的温度范围内表现最佳，与这些结论基本一致;培养料含水量方面，李发盛等［11］认为‘百云6号’的最佳培养基含水量是65%，而本研究表明各供试菌株在65%～70%的含水量菌丝长速最快，原因可能为不同云耳菌株的含水量存在一定的差别，但最适合的含水量范围基本一致;赵梓楠［12］认为5个黑木耳菌株在pH 5～9时菌丝长速变动不大，且菌丝较致密，菌落生长旺盛，郭砚翠等［13］也认为黑木耳8808菌株在pH 4～11.5时菌丝长势基本相同，本研究结果表明各供试菌株在pH 4～11时菌丝都可以生长，以pH 8～9为最佳酸碱度范围，说明黑木耳和云耳菌株适应的酸碱度范围较大，在偏酸和偏碱性的条件下都可以正常生长。因为在偏碱性条件下可以抑制部分杂菌的生长，因此，在培养料的配制过程中可以适当加入一些石灰粉使培养料的pH值调至碱性，从而达到抑制杂菌生长，减少污染的目的。以上结果表明，可对这5个野生云耳菌株开展进一步的栽培试验，以便对各菌株的出菇产量、外观品质、成份含量等性状进行评价及挖掘，以筛选出适合广西栽培的高产优质的本土云耳栽培品种。而TY081和TY026菌株可以作为抗霉性强的育种材料进行研究利用。