川西高寒山区野生药用黄芪根瘤菌的遗传多样性

2018-12-11江华明刘松青李仁全彭万仁张小平

西南农业学报 2018年11期

江华明，刘松青，李仁全，彭万仁，张小平

(1.四川职业技术学院，四川遂宁 629000;2.成都师范学院，四川成都 611730;3.四川农业大学资源学院，四川成都 611130)

【研究意义】川西高寒山区是指四川阿坝州、甘孜州区域内海拔1500 m以上的横断山区，位于青藏高原东部。该区域气候冷凉、降雨较少，昼夜温差大。其中，甘孜州属青藏高原气候，年均气温在5～10℃之间，年降水量在400～1000 mm之间，具有气温低、冬季长、日照足的特点。阿坝州山原地带为温凉半湿润气候，夏季温凉，冬春寒冷，干湿季明显;年平均气温5.6～8.9℃，且随着海拔高度的变化，气候从亚热带到温带、寒温带、寒带，呈明显的垂直性差异。川西高寒山区是青藏高原药用植物资源的重要分布区。黄芪属植物约2000多种，广泛分布于欧洲、亚洲、南美洲及非洲。我国278种，2亚种、35变种、2变型，本属植物主要用于牲畜饲料、药用和绿肥［1］。四川约有67种12变种1变型。甘孜州有47种9变种［2］。【前人研究进展】目前对川西高寒山区黄芪根瘤菌资源研究的不多。李琼芳［3］从四川省甘孜州海拔3650 m的瓦泽乡和海拔4250 m的折多山的黄花黄芪(Astragalus gilviflorus)和梭果黄芪(Astragalus stii)分离得到33株根瘤菌。采用数值分类和不同的分子生物学方法进行分析结果显示，33个菌株均属于 Mesorhizobium。周蜃等［4］对其中一个分支中包含SCAU7，SCAU11，SCAU27的菌株进一步进行共生基因(nodC、nifH)序列分析、DNA同源性分析、细胞脂肪酸组成成分分析，最终确定SCAU7T和SCAU27为新种群，命名为Mesorhizobium sangaii，菌株SCAU7T作为该新种的模式菌株。【本研究切入点】本研究从采集自四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族羌族自治州的10种具有一定药用价值的黄芪植物［1］(膜荚黄芪 Astragalus membranaceus，云南黄芪 A.yunnanensis，长小苞黄芪 A.balfourianus，单蕊黄芪 A.monadelphus，窄翼黄芪 A.degensis，肾行子黄芪 A.skythropos，康定黄芪 A.tatsienensis，厚叶黄芪 A.crassifolius，梭果黄芪 A.ernestil，弯齿黄芪A.camptodontus)的根瘤中分离根瘤菌，测定分离株的耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围等生理指标，并采用BOXAIR-PCR、16S rDNA PCR-RFLP及16S rDNA序列分析等方法。【拟解决的关键问题】揭示该区域野生药用黄芪根瘤菌的遗传多样性，为优良菌株的选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 根瘤样本的采集从四川甘孜州康定、道孚、炉霍、甘孜、稻城、雅江等6个县10个采样点及四川阿坝州黄龙寺采集到药用黄芪植物根瘤及土壤样品，并记录根瘤的形状及结瘤部位。

表1 药用黄芪根瘤菌供试菌株及参比菌株Table 1 Strains isolated from medicinal plants of Astragalus spp.and reference strains

注:R:Rhizobium，M:Mesorhizobium，Ag:Agrobacterium。

1.1.2 药用黄芪植物根瘤菌的分离和纯化药用黄芪植物根瘤菌的分离和纯化参照Vincent的方法［5］。用无菌水浸泡清洗根瘤，再用75%酒精和0.1%HgCl2分别对根瘤表面消毒5和3 min，用无菌水冲洗3次。在无菌培养皿中磨碎根瘤，取根瘤悬液在YMA平板上划线，置28℃恒温箱中培养7～10 d，挑取表面湿润、光滑、突起、有荚膜多糖产生的单菌落，采用划线法反复纯化，革兰氏染色镜检。阴性纯菌株接种于YMA斜面，28℃培养3d，4℃短期保藏，30%甘油管中－80℃长期保藏［6］。分离的供试菌株和参比菌株列表1。

1.2 BOXAIR-PCR 指纹分析

总DNA的提取参照 Little［7］的方法。提取的DNA保存于－20℃备用。BOXAIR-PCR指纹分析中，引物为 BOXAIR:5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’。反应体系(25 μl)为:2 × PCR Mix 12.5 μl;BOXAIR 引物(10 μM)0.5 μl;模板 DNA(50 ng/mL)1.0 μl;双蒸水11 μl;扩增程序:95 ℃变性4 min;95℃变性1 min，54℃复性1 min，65℃延伸8 min，循环35次;65℃最终延伸11 min。4℃保存。扩增产物经2%浓度的琼脂糖凝胶电泳(80 V，2 h)检测，凝胶UV成像系统成像，以JPG形式保存［6］。

1.3 16S rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析

以总DNA为模板，选用来源于大肠杆菌16S rDNA基因序列保守区域的两段引物P1和P6来扩增16SrDNA。正向引物P1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’。其序列对应于 E.coli第8-37碱基位置;反向引物P6:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’。其序列对应于E.coli第1479～1506碱基位置。扩增16SrDNA和酶切反应体系反应体系请参见文献［6］。

1.4 供试菌株16S rDNA序列测定及系统发育分析

扩增全部35株供试菌株的16S rDNA片段(反应体系和程序同1.3)，扩增产物(1500 bp)经检测后送北京华大基因有限公司测定序列。

1.5 菌株生理特性分析

对35株根瘤菌分别进行耐盐性、初始pH生长范围及生长温度范围的测定［6］。

1.6 数据分析和处理

采用Nei等［8］的方法计算材料间遗传相似系数(GS)，GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中，Ni代表第 i个品种的扩增带纹数目，Nj代表第j个品种的扩增带纹数目，Nij代表第i、j个品种间共有的带纹数目。通过NTSYS2.10e软件中的基于非加权成对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，并转化为树状图谱;利用NTSYS-pc(Version 2.10e)软件进行GS相似性系数分析，并通过EIGEN程序进行主成分分析;将所测供试菌株16S rDNA序列提交GenBank数据库，获取序列号(表1)。采用 Blast search在线分析及DNAMAN6.0软件进行序列比对，找出各序列在NCBI数据库中最近缘种的模式菌株序列，再用MEGA 5.0中的Clustal X程序进行多序列比对，用Neighbor-Joining方法选择Bootstrap为1000个重复构建系统发育学进化树［6］。

2 结果与分析

2.1 药用黄芪根瘤菌分离及BOXAIR-PCR指纹分析

从10种药用黄芪(膜荚黄芪Astragalus membranaceus，云南黄芪 A.yunnanensis，长小苞黄芪 A.balfourianus，单蕊黄芪 A.monadelphus，窄翼黄芪 A.degensis，肾行子黄芪 A.skythropos，康定黄芪 A.tatsienensis，厚叶黄芪 A.crassifolius，梭果黄芪 A.ernestil，弯齿黄芪A.camptodontus)的根瘤中分离得了35个根瘤菌菌株作为供试菌株，另外，选取了属于 Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Agrobacterium的参比菌株14个(表1)。对这些菌株开展了系列研究。

以各菌株总DNA为模板，BOXAIR为引物，对35株供试药用黄芪植物根瘤菌进行BOXAIR-PCR，在2%琼脂糖凝胶电泳板上得到BOXAIR-PCR指纹图谱(图1)。

在相似系数84.6%的水平，35个药用黄芪供试菌株和14个参比菌株中，除6个供试菌株单独分开(SCAU 609;SCAU487;SCAU596;SCAU491;SCAU549;SCAU550)外，其余菌株聚成6个遗传群(图2)。

将采用UPGMA法进行聚类分析的结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行Mantel检验。结果表明，2种矩阵显著相关，相关系数 r=0.853，P=0.005，说明聚类结果能较准确地反映菌株之间的遗传关系。

图1 药用黄芪根瘤菌部分菌株BOXAIR-PCR指纹图谱Fig.1 BOXAIR-PCR figureprints of the strains isolated from medicinal plants of Astragalus sp.

图2 药用黄芪根瘤菌BOXAIR-PCR聚类分析图Fig.2 Dendrogram based on BOXAIR-PCR fingerprints of the strains tested

2.2 16S rDNA PCR-RFLP聚类分析和主成分分析(PCA)

2.2.1 PCR-RFLP聚类分析由图3可知，以P1和P6为引物对49个菌株(35个供试菌株和14个参比菌株)的16S rDNA进行特异性扩增，分别用Hae III、Msp I、Hinf I和 Taq I对扩增的 1.5 kb 片段进行酶切，2%琼脂糖凝胶(含EB)电泳形成图谱。

对49个菌株的16S rDNA扩增产物的酶切条带利用UPGMA进行聚类分析并生成树状图谱。

在相似系数83%的水平上，所有供试菌株均与参比菌株完全分开。在供试菌株中，SCAU549、SCAU568、SCAU596单独分开，其余菌株聚成4个遗传群。

图3 药用黄芪根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP聚类Fig.3 Dendrogram based on 16S rDNA PCR-RFLP of the tested strains

图4 药用黄芪根瘤菌及参比菌株16S rDNA PCR-RFLP主成分分析三维图Fig.4 3-d PCA for 16S rDNA PCR-RFLP of strains isolated from medicinal plants of Astragalus and reference strains

将采用UPGMA法进行聚类分析的结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关性进行Mantel检验。结果表明，2种矩阵显著相关，相关系数 r=0.835，P=0.005，说明聚类结果能较准确地反映菌株之间的遗传关系。

35个供试菌株4种酶酶切后共形成27种基因型，通过Simpson指数公式D=1－ΣPi2(Pi为16S rDNA某基因型个体数占总个体数的比例，即第i个等位基因变异出现的频率)计算出35株药用黄芪根瘤菌遗传多样性指数D=0.916，表明该地区药用黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性。

2.2.2 主成分分析应用 NTSYS-pc(Versin 2.10e)软件对49个菌株(斜茎黄芪35个供试菌株和14个参比菌株)16S rDNA-PCR的相似系数进行主成分分析，用EIGEN程序作主成分之间的三维关系图(图4)，前3个主成分所能解释的相关性分别为28.82%、16.54%和14.45%。主成分分析与16S rDNAPCR聚类结果基本一致:26.SCAU568单独分开。群I:6.SCAU480，7.SCAU487，8.SCAU489;14.SCAU533;15.SCAU534;16.SCAU536;17.SCAU540;18.SCAU542;34.SCAU 609;24.SCAU550;25.SCAU551;27.SCAU591;33.SCAU597;群 II:30.SCAU 594;32.SCAU596;31.SCAU595;21.SCAU545;22.CAU546;群IV:1.SCAU470;2.SCAU471;3.SCAU472;4.SCAU473;5.SCAU474;群 V:11.SCAU516;12.SCAU517;13.SCAU519;群 VI:9.SCAU490;10.SCAU491;23.SCAU549。群 VII:19.SCAU543;22.SCAU546;45:R.etli CFN42。而35.SCAU611 与中慢生参比菌株 41:M.temperatum SDW 018T、42:M.tianshanense CCBAU 3306T、47:M.amorphae ACCC 19665T聚成群VIII;29.SCAU593在16SrDNA-RFLP中属于 PhenonII，但在主成分分析中则与 28.SCAU592聚成群III。

图5 药用黄芪供试菌株16S rDNA系统发育树状图Fig.5 Phylogenetic tree constructed by 16S rDNA sequences of tested strains

2.3 药用黄芪根瘤菌16S rDNA序列测定和系统发育分析

根据BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA分析结果，选取20个代表菌株测定16S rDNA序列(北京华大基因科技股份有限公司)，构建了供试菌株的16S rDNA系统发育树状图(图5)。结果表明，20个代表菌株在系统发育树状图中分成2个大遗传群:SCAU516、SCAU517、SCAU519、SCAU594、SCAU595、SCAU597、SCAU470、SCAU471 与 Rhizobium 聚群，其中，来自同一宿主的根瘤菌聚成一个小群。

其余供试菌株均聚在Rhizobium-Agrobacterium:SCAU 542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568形成一个独立的分支;SCAU540、SCAU551、SCAU611、SCAU591、SCAU609、SCAU550 与 Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T形成一个小分支，表明这6个菌株与Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T的亲缘关系很近;而SCAU596形成一个独立的分支。

2.4 药用黄芪根瘤菌抗逆性分析

对35个菌株分别进行耐盐性、初始pH生长范围及生长温度的测定。结果表明:27/35的菌株既能在4℃又能在45℃的恒温条件下生长，8/35的菌株能在1037℃的恒温条件下生长，所有菌株能在60℃(处理10 min后置28℃)条件下生长。表明供试根瘤菌对温度的适应范围较宽，对温度的耐受性表现出较大的多样性。28/35的菌株能在pH 4～10的培养基上生长，5/35的菌株能在pH 4～8的培养基上生长，而SCAU533、SCAU536仅能在pH6～8的范围内正常生长。除12/35的菌株不能在1%NaCl的YMA培养基上生长外，多数(23/35)菌株能在2% ～8%NaCl的YMA培养基上生长，其中，SCAU542、SCAU543、SCAU544、SCAU545、SCAU546等5个菌株能在8%NaCl的培养基上生长。

3 讨论

35个菌株在16S rDNA PCR-RFLP分析中除SCAU549，SCAU568，SCAU596 单独分开外，其余菌株聚成4个遗传群(相似系数83%);在BOXAIRPCR分析中则聚成6个遗传群(相似系数84.6%)。很多在16S rDNA PCR-RFLP中具有相同遗传类型的菌株也有较大差异，因此，和16SrDNA PCRRFLP结果相比较，BOXAIR-PCR指纹图谱分析揭示的遗传信息更为丰富［9］

采用2种方法对35株药用黄芪根瘤菌菌株和14个参比菌株进行聚类结果较为一致，均显示:除少数供试菌株与参比菌株聚在一起外，其它供试菌株都独自成群，表明大多数供试菌株和参比菌株间有较大的遗传差异，药用黄芪根瘤菌具有丰富的遗传多样性。是否预示着有潜在的新种，尚需进行功能基因的分析。

16S rDNA序列分析是能较精确地揭示根瘤菌的系统进化关系的一个重要手段［10］。16S rDNA序列比对结果表明，分离自10种黄芪植物根瘤的35株药用黄芪根瘤菌分别属于Rhizobium(20/35株)、Ochrobactrum(3/35株)、Rhizobium-Agrobacterium(12/35株)。

在系统发育树状图中，供试菌株 SCAU 542、SCAU433、SCAU434、SCAU436、SCAU568 聚在 Rhizobium-Agrobacterium: 而 SCAU540、 SCAU551、SCAU611、SCAU591、SCAU609、SCAU550 与 Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T形成一个小分支，显示这6个菌株与Agrobacteriumtumefaciens ATCC 23308T的亲缘关系很近。这表明根瘤菌属与土壤杆菌属在种的系统发育上互有交叉，这与Kwon SW等的研究结果相一致［11］。

一般认为，根瘤菌的最适生长温度为25～30℃，只有少数苜蓿根瘤菌菌株在42.5℃下生长，极少数根瘤菌4℃条件下生长，根瘤菌在60℃条件下处理5 min即全部被杀死。

对药用黄芪根瘤菌供试菌株生长温度测定结果显示，27/35的菌株既能在4℃又能在45℃的恒温条件下生长，8/35的菌株能在10～37℃的恒温条件下生长，所有菌株能在60℃(处理10 min后置28℃)条件下生长。表明供试根瘤菌对温度的适应范围较宽，对温度的耐受性表现出较大的多样性。

根瘤菌生长的最适pH 6～7。35个药用黄芪根瘤菌菌株的宿主植物生长的土壤pH 4～7.07之间，均属酸性、中性偏酸环境，所有菌株均能在pH 4或5的培养基上生长。其中，28/35的菌株能在pH 4～10的培养基上生长，5/35的菌株能在pH 4～8的培养基上生长，而SCAU533、SCAU536仅能在pH6～8的范围内正常生长。韦革宏等［12］对18株分离自陕甘宁地区5种黄芪植物(扁茎黄芪Astragalus complanulus，直立黄芪Astragalus adsurgens，糙叶黄芪Astragalus scubuerrumus，金翼黄芪Astragalus chrysupterus，内蒙黄芪Astragalus mongulicus)根瘤菌的生理生化指标测定结果表明，全部供试菌株在pH 4～5的酸性环境中不能生长，却在pH11的碱性环境中能生长，与其他来源的根瘤菌相比，它们具有较强的耐碱能力。表明根瘤菌适应环境的能力是宿主植物、无机环境因子对菌株长期自然选择的结果。

影响微生物生长的胁迫因素中，盐分被认为是最具危害性的非生物类胁迫因素之一。除少数(12/35)的菌株不能在1%NaCl的YMA培养基上生长外，多数(23/35)菌株能在2% ～8%NaCl的YMA 培养基上生长，其中，SCAU542、SCAU543、SCAU544、SCAU545、SCAU546等5个菌株能在8%NaCl的培养基上生长。