肉制品鉴别的分子生物学方法研究进展

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(1.华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510006; 2.广东检验检疫技术中心 广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室,广东广州 510623)

古书《五灯会元》中有“悬羊头,卖狗肉”一说,原以此借喻表里不一,但在食品安全中,却屡屡出现真实的挂羊头卖狗肉事件,现今世界各国每年都会有许多肉类掺假事件被曝光:2013年初的欧洲马肉风波;2013年末的沃尔玛超市狐狸肉掺假事件;2015年初“忆思”牌牛肉干事件等等。这些食品掺假事件被统称为“经济利益驱动的掺假”(Economically Motivated Adulteration,EMA)。

从2013年开始,我国就稳居世界第一大肉类生产国,年产量逐年上涨,国家统计局数据显示2017年猪牛羊禽肉产量8431万吨。我国肉类生产成本高导致各种肉类的价格高、差异大,市场中存在大量低价肉冒充高价肉,非食用肉冒充食用肉的现象。据新发地批发市场报价,禽类与猪肉,猪肉与牛、羊肉有几倍的差价,这种高额的利润使得不法分子铤而走险,食品掺假屡禁不止。2013年,我国部分地区开展了肉及其制品的掺假情况调查,结果显示有25.6%的样品与标识不符。这些违法行为不仅侵害了人民的合法权益、损害了人民的身体健康,而且当猪肉制品掺入到清真食品中造成的恶劣影响会引发宗教事件,不利于社会的和谐稳定。

由于监管需求,各种动物物种检测技术相继被开发出来。最初检验人员使用显微镜识别区分不同物种,以发现造假行为,后来科学家又开发出基于蛋白质和脂质的检测方法,主要包括光谱学方法、免疫学方法、色谱和质谱技术,然而这些方法技术都存在着各种弊端,光谱学方法需要建立复杂的模型,但模型不具有通用性;免疫学方法的灵敏度偏低,存在较多的假阳性结果;色谱和质谱技术对仪器设备的要求比较高,并且容易产生假阳性结果,因此这些方法不能很好的满足监管的需求。在过去二十年里,基于核酸的分子生物学技术发展迅猛,因为核酸存在于大多数细胞中,其结构保守,高温下具有更好的稳定性。所以随着分子生物学检测技术的蓬勃发展,使得肉类物种鉴别有了真正可靠的方法技术。

本文主要对禽畜鱼的原料肉及加工肉制品的七种分子生物学掺假鉴别方法的研究进展进行介绍和分析,并对未来的研究方向进行了探讨和展望。

1 常规PCR方法

PCR是一种生物体外的聚合链式扩增反应,可以在几小时内通过引物和酶对特定的核酸序列进行数百万次扩增。这种技术由Mullis等[1]发明。常规PCR方法的原理是经PCR扩增特异性片段后,利用琼脂糖凝胶电泳,观察电泳后的结果,根据阴阳性或片段大小以鉴定区分不同物种。已经成为肉类掺假检验领域的常规技术方法,得到了广泛的应用。

Cunningham等[2]证明PCR方法在活体动物和动物制品的检测上很有帮助。Herman等[3]采用细胞色素b序列设计引物,成功的检测出食品中的鸡、火鸡、猪、牛、绵羊成分。Piknova等[4]也利用细胞色素b序列检测出食品中的牛成分。Montiel等[5]设计了基于D环区的引物,可以在腌制或热加工食品中扩增出531 bp的DNA序列,以此来鉴别猪肉。他们还通过简单的AvaII分析来分辨野猪和家猪。Calvo等[6]设计了猪的特异性引物,在猪的生熟肉、香肠、烟熏肉、馅饼等各种加工品中成功的检测出了猪肉。这个方法也用在了生熟牛肉和鸭肉中猪肉的检测。Arslan等[7]设计实验测定了不同加工方法对于线粒体DNA的PCR扩增的效果的影响,在煮、烤、高压和煎等烹饪方法中,除煎制80 min后的样品,其余加工后样品均检测出牛源性成分。这些科学家的实验结论说明了DNA在高温高压加工处理后仍具备PCR扩增的能力,也证明了PCR方法可以应用于加工肉制品的检测中。Ilhak等[8]采用一种鉴别的新思路,通过PCR扩增马、狗、猫、牛、绵羊、猪和山羊,最终产物分别为439、322、274、271、225、212、157 bp,观察琼脂糖凝胶电泳中片段的大小,最低可以鉴定出混合肉中0.1%含量的掺假成分。Kesmen等[9]开发了一种高效的特异性PCR方法,利用线粒体DNA设计引物,可以检测出香肠中低含量的猪肉、马肉和驴肉,最低可检测0.01 ng的目标DNA。当使用混合肉样进行检测时,可以检测出低至0.1%含量的物种源性成分。常规的PCR方法的应用开创了物种鉴别的PCR时代,由于常规PCR方法一次只能检测一种物种,局限性大,科学家又在此基础上开发了其他新型PCR方法。

2 多重PCR方法

多重PCR方法是将多个引物对用在一个PCR反应体系中,利用一个模板反应可以得到多个扩增片段。利用此方法,在一次PCR反应中使用基于细胞核DNA和线粒体DNA的多个引物对,可以精确检测多种物种成分。

Fei等[10]利用D环区设计引物,通过多重PCR反应可以一次性鉴定牛肉、猪肉和鸡肉。Behrens等[11]利用多重PCR对复杂样品中的鸡肉、火鸡肉、牛肉、猪肉、山羊肉、驴肉和马肉进行区分鉴定,其中加工后样品的最低检测限为1%。Yin等[12]使用12S rRNA基因序列,设计了三对引物,利用多重PCR方法,对牦牛肉和牛肉进行鉴别,牛肉的PCR反应产物有两种片段,大小分别为290、159 bp,而牦牛肉的PCR反应产物只有一种片段,大小为290 bp。利用这种方法,可以对牦牛和牛的混合生肉和混合熟肉进行区分鉴定,得到了很好的效果,其中牛肉的检测低限在0.1%。张全芳等[13]利用16S rRNA序列的差异,设计引物,进行多重PCR可以成功区分绵羊、山羊和狐狸。多重PCR依据不同的需要从最初的双重PCR发展为四重PCR[14]、五重PCR[15-16]和六重PCR[17-18]甚至七重PCR[19-20],同时检测的物种数量逐步增多。多重PCR技术完美继承了常规PCR的优点,又可以在同一次反应中检测多个物种,大大节约了实验成本。

3 限制性片段长度多态性PCR方法

限制性片段长度多态性PCR方法是利用常规PCR方法扩增出目标片段,然后将产物用特异性内切酶消化切割为不同长度的片段,最后通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等方法,观察分析电泳结果得出结论。

Ali等[21]利用猪的细胞色素B基因设计引物,进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析,能够成功的检测到0.0001 ng的纯猪肉,并且可以在猪肉、牛肉和小麦的混合物中检测出猪源性成分,最低检测限可达0.01%。Ong等[22]利用细胞色素B基因,经过一轮PCR反应后,分别使用不同的内切酶处理PCR产物,猪肉产物可以分别被AluI和BsaI切割成两个片段,鸡肉产物可以被RsaI切割成两个片段,牛肉产物可以被AluI切割为三个片段,被BsaI切割成两个片段,这些片段的大小均不相同,利用琼脂糖凝胶电泳可以清晰观察并得出模板的动物种类,一轮PCR反应可以分辨多种物种,节约了成本。Sun等[23]在PCR反应中加入R6G dCTP,生成带有荧光信号的产物,酶切后利用毛细管电泳分析,可以在肉类混合物中分别检测出低于1%含量的猪、羊和牛源性成分,并且烹饪和高压处理不会影响检测的准确性。Yuny等[24]利用RFLP方法对印尼地区的部分牛肉丸进行了检测,发现了一些牛肉丸中有猪肉的阳性信号,证明了RFLP方法在实际监管过程中能够起到检测的作用。RFLP方法虽然有着很好的检测效果,但是其可重复性偏低,易受到内切酶的影响,并且比常规PCR方法复杂,实验成本高,因此在实际监管中应用较少。

4 DNA分子杂交方法与基因芯片技术

DNA分子杂交检测技术是将生物体内的DNA双链变性为DNA单链,人为添加带有荧光或同位素的互补链,如果两者之间形成碱基互补,那么会检测到阳性信号。

这种技术在1987年第一次应用于肉类检测中[25],Buntjer等[26]建立了牛、羊、马、鸡、猪等多种物种的分子杂交检验方法,在混合肉中可以检测到最低1%的动物源性成分,在4 h内可以检测50种样品,并且对于热加工的样品依然具有很好的检测效果。Buntjer等[27]对加工肉制品作为样品的DNA杂交进行了研究,发现肉的冷冻与解冻过程不会影响DNA杂交的效果,而100、120 ℃的高温处理可能会导致DNA的降解,但是不会影响最终的物种鉴别。DNA杂交技术作为一种基础的检测技术,存在有耗时长,灵敏度低等许多缺陷,所以科学家发明了一些基于DNA杂交原理的改进版新型检测技术[28]。

基因芯片技术是基于DNA分子杂交原理的新型检测技术,其将大量的探针序列固定在支持物上面,可以实现对样品快速方便的检测。朱业培等[29]建立了一种可以同时检测牛、羊、猪、马、鹿和兔6种物种源性的基因芯片,牛源性成分和马源性成分的相对检测低限达到了0.001%。Kochzius等[30]开发了一种含有64个探针的基因芯片,利用一张芯片可以同时检测30种不同的鱼类。DNA芯片技术结合了PCR和DNA杂交的优点,逐渐得到监管部门和食品行业的重视。目前采用DNA芯片技术的国家标准检测方法《常见动物源性成分快速测定 膜芯片法 GB/T 35917-2018》已经起草即将于2018年9月1日实施。随着国家标准的即将实施,此方法将越来越多的应用于实际检验中。

5 实时荧光PCR方法

实时荧光PCR方法是在常规的PCR体系中添加荧光基团,利用机器监测荧光信号的变化,可以实时监控PCR反应过程,以实现对样品的定性和相对定量。在物种鉴别中,荧光PCR方法是比较先进的技术,结果直观易观察,避免了琼脂糖凝胶电泳中的污染问题。

Wolf和Jurg[31]使用基于生长激素基因设计的引物,对猪肉进行鉴定,即使样品在115 ℃中加热2 h,使用荧光PCR方法在样品中也可以检测到低至0.1%含量的猪肉。科学家利用实时荧光PCR研发了多种定量方法。Mendozaromero等[32]实现了基于实时荧光PCR方法的反刍动物的相对定量,能够最低检测到10 tg的牛DNA。Kim等[33]利用D环区设计引物,可以最低检测出0.1 pg的猪DNA。Xiang等[34]从细胞核DNA中找到了细胞骨架肌动蛋白基因,并验证了其特异性,定量检测限为10 pg。Druml等[35]开发了鹿的荧光PCR方法,在混合肉的实验中效果良好,定量限小于0.5%。Furutani等[36]利用特制的便携式荧光PCR装置,可以在16 min内完成45个循环的荧光PCR反应,准确高效的检测出食品中的猪、牛、鸡等物种。这个方法一定程度解决了监管部门在现场快速检验的需求。刘艳艳等[37]将多重PCR与实时荧光PCR结合起来,综合利用细胞核DNA和线粒体DNA设计了三对引物和五种探针,采用多重荧光PCR方法在一轮PCR中可以同时区分出驴肉、马肉和骡肉。实时荧光定性PCR是现在肉类鉴定中最主要的方法之一,其相关标准和检测方法众多。

6 数字PCR方法

数字PCR技术诞生于1999年,2003年发明了BEAMing技术[38],在此基础上于2006年发明了基于芯片法的数字PCR仪,2011年发明了基于微滴法的数字PCR仪[39]。数字PCR将基因样品分散到大量的独立反应空间中,每个空间中含有大约一个基因拷贝,利用模板特异性引物探针来检测PCR的最终产物,在对所有空间进行PCR反应后,利用计数器测量PCR产物的荧光强度,通过泊松统计分析得到数据。现在主要有两种数字PCR技术:芯片式数字PCR(chip digital PCR,cdPCR)和微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)。与实时荧光PCR的相对定量所不同,利用数字PCR反应可以对样品进行绝对定量分析,消除本底信号的干扰。Scollo等[40]对数字PCR和实时荧光PCR进行了对比实验,发现数字PCR具有更好的分辨率。

Floren等[41]利用基因组DNA与线粒体DNA分别设计的引物探针进行动物源性成分的定量检测,通过实验发现线粒体DNA在不同的细胞组织中含量分布不均匀,不适用于定量分析,而基因组DNA在不同的细胞组织中含量恒定,适用于定量分析。因此针对数字PCR的定量需求,需要对不同物种开发基于基因组DNA的新引物探针。苗丽等[42]利用单拷贝基因对样品中的羊进行定量分析,成功建立了拷贝数与DNA浓度,DNA浓度与样品质量的关系式,可以达到绝对定量的要求,检测低限达到10%。任君安等[43]利用数字PCR测得羊与猪的拷贝数比率,并与实际样品中,羊和猪的质量比率进行对比,发现可以最低检测出1%的猪肉。数字PCR作为一种新型PCR方法,在定量应用中有着广阔的前景,可以区分有意掺假和无意沾染。对于深加工的肉制品理论上可以做到精确定量,满足监管的需求。表1总结了国内外利用数字PCR对肉制品检测的现状。

表1 数字PCR对肉制品检测的定量限Table 1 Limit in meat adulteration detection by digital PCR

7 DNA条形码技术

现今的大多数检测方法并没有实现系统性和标准化,不同监管部门可能使用不同的基因来鉴别同一种物种,这不利于监管的科学化管理。加拿大科学家Hebert[49]于2003年提出了DNA条形码技术。DNA条形码技术是一种利用短的DNA序列对物种进行鉴别的技术,现今大部分动物采用COI基因作为条形码标准片段[50]。李新光等[51]利用DNA条形码技术对15种烤鱼片进行鉴定,发现仅有一种烤鱼片与包装标识相符,因此市场中存在大量的造假行为。Cardeosa等[52]在广州的市场上采购了200种鲨鱼鱼鳍,这些鱼鳍中只有0.5%含有完整的COI序列,但是最终利用DNA条形码技术仍然能够成功鉴别其中的170种鱼鳍的种属,其余30种由于其扩增产物质量较差,导致了鉴别的失败。Vartak等[53]利用DNA条形码技术对11种食用蟹进行了成功的鉴别,发现在抽查的50份蟹肉样品中,全部出现样品与标识不符,造假比率达到100%。DNA条形码技术作为一种新型检测技术,对于监管的标准化起到了重要的作用。现在的研究主要在水产品方向,仍然需要在禽畜等方向进行大量的研究。

8 结论与展望

目前,分子生物学检测方法在肉类和肉制品的物种鉴定中得到广泛的应用。分子生物学检测方法相比其他检测方法有着巨大的优势:核酸相比蛋白质要更加稳定;核酸在生物体内大量存在,分布均匀;基于核酸方法的检测成本更低、精确度更高;核酸在不同物种间具有更高的特异性。由于其他方法具有非常多的局限性,而分子生物学检测的方法具有适用广、精度高、结果稳定等优点。因此分子生物学方法现在已经逐渐成为物种鉴别领域的主要检测方法。

在这些分子生物学检测方法中,常规PCR和多重PCR方法是分子生物学检测中最基础的方法。RFLP方法具有较好的检测效果,但可重复性差,因此较少应用于实际检测。DNA杂交技术存在有耗时长,灵敏度低等许多缺陷,因此较少应用于实际检测。目前实时荧光PCR方法逐渐成为了监管应用中的主角,其具有高效直观灵敏度高的特点。但是这种方法也有一些不足之处,主要体现在检测仪器昂贵,对实验室条件要求高,一般无法进行快速检测等方面。数字PCR、基因芯片技术和DNA条形码技术仍需要进一步的研究发展以满足监管需求。

在未来的研究中,分子生物学检测方法可以向快速高效低成本的方向发展,完善优点克服缺点。现阶段利用这些方法进行定性检测的研究已经发展的比较成熟。未来应该在定量检测方面投入更多的研究精力,区分无意沾染和有意掺假是研究的新趋势。在物种鉴别领域,这些分子生物学方法还有许多可以发展进步的空间,科研工作者应该继续深入研究。