超高效液相色谱串联质谱法测定食品中柑橘红2号和苏丹红Ⅰ～Ⅳ染料

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(山东省食品药品检验研究院,山东济南 250101)

柑橘红2号和苏丹红Ⅰ～Ⅳ 均属于脂溶性偶氮类染料,主要在石油、机油和其他的一些工业溶剂中作为工业染料使用[1]。因这些工业染料具有着色稳定、色泽艳丽、价格低廉等特点,一些不法商家将其添加到食品中进行染色,以提高其市场竞争力。柑橘红2号和苏丹红染料在化学结构上均具有偶氮骨架,这种结构决定了其具有一定的致癌性[2]。据世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)1995年确定,苏丹红属第三类致癌物质;欧盟国家已在1995年禁止其作为食用色素,我国已明确将苏丹红列在《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中。世界卫生组织认为柑橘红2号具有致癌危险,对人体的肝脏、肾脏器官具有明显的毒副作用,也不能作为食品添加剂用于食品中[3]。但近几年各国仍不断有食品中添加化工染料的食品安全事件发生。一些不法食品企业把苏丹红添加到食品中,曾引发“红心鸭蛋”、“亨氏辣椒酱”等食品安全事件。而近几年水果市场也相继发现“染色橙”食品安全问题,香港食物环境卫生署抽查39个橙类样品,发现1/3的样品橙皮中含禁用及可能致癌的柑桔红2号色素。滥用非法染料给食品安全及消费者健康带来了巨大的隐患。因此,建立快速、准确且能同时检测柑橘红2号和苏丹红的检测方法,对食品中非法染料的市场监管具有重要意义。

柑橘红2号和苏丹红染料的测定方法有薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、气相色谱法及酶联免疫测定法(ELISA)等方法[4-7]。其中以液相色谱法应用最为广泛,但液相色谱法存在灵敏度较低,特别对于复杂基质,无法满足痕量检测的定性定量等问题[5-10]。高效液相色谱-三重四级杆串联质谱因其高灵敏度、高选择性及定量定性准确等特性,成为目前此类禁用物质的最佳检测方法[11-14]。前处理过程方面有直接提取法[15]、氧化铝柱净化方法[16]、凝胶渗透色谱(GPC)净化方法[17]和氨基柱净化方法[1,3]。其中，直接提取和氧化铝净化的方法去除背景干扰能力差,凝胶渗透色谱净化的方法耗时长,耗溶剂多,易交叉污染。氨基固相萃取柱具有正相和阴离子交换双重保留作用,被应用于复杂基质中结构相近的化合物的检测中。目前对辣椒制品等食品中苏丹红的研究报道较多,而同时检测多种基质中柑橘红2号和苏丹红染料的方法鲜有报道[17-20]。

本研究采用乙腈提取,NH2固相萃取柱净化富集,高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测,以期建立适用于水果、蜜饯、辣椒制品、火锅底料及肉制品中柑橘红2号和苏丹红染料同时检测的方法。并对该方法的灵敏度、选择性、检出限进行评价,为食品中痕量水平非法染料的定性、定量检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脐橙、蜜饯(山楂卷)、辣椒油、火锅底料(红油半固体)及香辣肉灌肠等样品 均购自济南当地超市;柑橘红2号(纯度≥90.0%)、苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准物质(纯度≥90.0%) 上海安谱科学仪器有限公司,4 ℃保存;甲醇、乙腈(色谱纯) 美国Fisher公司;甲酸、醋酸铵(色谱纯) 美国Sigma-Aldrich公司;水 为Milli-Q超纯水机制备;氮气(>99.999%);氨基固相萃取柱(500 mg,3 mL)、色谱柱 Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) 美国Waters公司;有机微孔滤膜(0.22 μm) 上海安谱科学仪器有限公司。

ACQUITYTM超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S质谱仪配有电喷雾(ESI)电离源和MasslynxTM色谱工作站 美国Waters公司;Sigma 3-18K高速冷冻离心机 德国Sigma公司;超声波清洗器 宁波新芝生物科技有限公司;MS3涡旋混合器 IKA公司;N-EVAP-45位氮吹仪 美国Organomation公司;SQP-电子天平 塞多利斯科学仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;粉碎机 德国莱驰公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备溶液的配制 准确称取各标准物质适量,用乙腈溶解并定容,配制成200 μg/mL标准储备液,于4 ℃条件下保存,分别吸取各标准储备液配制成10 μg/mL混合标准工作液,4 ℃条件下保存。

1.2.2 色谱及质谱条件

1.2.2.1 质谱解析及条件的优化 柑橘红2号同苏丹红染料均为含有萘母体骨架的偶氮染料,因此对其较为相似的子离子碎片进行解析,对于此类物质的准确定性具有较好确证作用。在二级质谱全扫描模式(Q1为单离子监测SIM,Q3为全扫描full scan)下获得该目标物的碎片离子指纹图谱。二级全扫描模式为定性的强有力手段,但在定量上相比多反应检测扫描(MRM)灵敏度还是不足,选用MRM扫描模式,确定定性离子对及定量离子对,并优化裂解电压、碰撞能量等参数。

1.2.2.2 色谱条件的优化 在优化的质谱条件下,考察不同流动相对目标物质谱信号的影响。选用BEH C18色谱柱,分别以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液进行实验。

1.2.2.3 色谱条件 色谱柱:BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:乙腈(A)和0.1%甲酸-水溶液(B),梯度洗脱程序(A):0～2.0 min:10%→50%;2.0～3.0 min:50%→95%;3.0～7.0 min:95%保持4 min;7.0～7.1 min:95%→10%;7.1～9.0 min:10%保持。流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃;进样体积:2 μL。

1.2.2.4 质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI);离子化模式:正离子模式(ESI+);毛细管电压:3.0 kV;锥孔电压:25 V;脱溶剂气温度500 ℃;离子源温度:150 ℃;脱溶剂气流速:850 L/h;锥孔气流速:150 L/h;碰撞气流速:0.12 mL/min;扫描方式:多反应监测(MRM);5种非法染料的定性离子定量离子对及质谱参数见表1。

1.2.3 前处理条件的优化

1.2.3.1 样品提取剂的选择 考虑到5种偶氮染料的亲脂性特点和各种食品等基质较复杂等原因,对实验提取溶剂进行了研究。

1.2.3.2 前处理方式的选择 为了优化较好的前处理净化手段,分别比较直接提取、中性氧化铝柱[18]和氨基柱三种前处理方式进行比较。并对三种方式最终提取液的总离子流图及基质效应进行研究来比较净化效果。

1.2.3.3 样品除脂探索 参考文献[8]方法,以辣椒油和火锅底料为对象,考察经过正己烷脱脂和不脱脂对目标物回收率的影响。

表1 5种非法染料的质谱参数Table 1 Optimized parameters of MS/MS for five illegal dyes

注：*为定量离子。 1.2.3.4 定容体积的选择 以脐橙、蜜饯、辣椒油、火锅底料及香辣肉灌肠等基质为研究对象,每类基质添加50 μg/kg含量水平的标准物质,按照1.2.3步骤进行前处理,每个基质做3个平行,定容体积分别为5、10和15 mL,考察不同定容体积对目标物响应及基质效应的影响。

1.2.4 样品前处理

1.2.4.1 样品制备 固体样品(脐橙、蜜饯、香辣肉灌肠)切小块,以10000 r/min转速粉碎5 min,充分粉碎、混匀,其中水果样品全果粉碎;半固体样品(火锅底料)直接用粉碎机以5000 r/min转速,粉碎5 min,粉好的样品分装于洁净容器中;液体样品(辣椒油)摇匀后备用。

1.2.4.2 样品提取及净化 称取1.2.4.1中制备的样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加入2 g氯化钠,涡旋1 min,加入10 mL乙腈,涡旋1 min,超声20 min,以8000 r/min转速离心3 min。取上清液乙腈层移入15 mL离心管中,40 ℃氮吹干,加入3 mL乙腈-二氯甲烷(1+99)溶液复溶,待净化。

用6 mL乙腈+二氯甲烷(1+99,体积比)活化氨基柱,待液面降至柱床时,将待净化液转移至固相萃取柱,同时收集流出液。用3 mL乙腈+二氯甲烷(1+99,体积比)清洗离心管两次,淋洗并收集流出液。合并流出液,40 ℃氮气流下浓缩至干,以甲酸-乙腈(1%)溶液复溶,并定容至10 mL,过微孔滤膜后,供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.5 标准溶液的制备 称取5份相同的空白基质样品,分别加入一定浓度的标准储备溶液(1.2.1.1),按1.2.4.2的步骤制备得到含量为2、4、10、20、40 ng/mL的基质配标,得到本实验所用的基质标准溶液。

1.2.6 线性范围、决定系数及定量限 称取5份相同的空白基质样品,分别加入一定浓度的标准储备溶液(1.2.1.1),按1.2.4.2的步骤制备得到含量为2、4、10、20、40 ng/mL的基质标准系列工作溶液。将标准工作溶液按浓度由低到高依次测定,以各物质定量离子对的峰面积(Y)对其质量浓度(X)作标准曲线。分别在空白基质中加10、5 μg/kg的目标物,按1.2.4前处理方法处理后,测试其信噪比,分别确定定量限和检出限。

1.2.7 回收率和精密度 分别在脐橙、蜜饯、辣椒油、火锅底料和香辣肉灌肠5种基质的阴性样品中进行10、50、100 μg/kg三个浓度水平的柑橘红2号和苏丹红的加标回收和精密度实验,每个浓度水平重复测定6次。

1.2.8 基质效应实验 取空白基质样品,按1.2.4的步骤制备空白基质溶液。分别用空白溶液和定容溶剂稀释标准储备液,得到同浓度水平的测定液。通过分别测定样品空白提取液与纯溶剂中添加同水平目标成分的响应值,计算二者的相对比值来评价基质效应(Matrix effect,ME),ME(%)=(基质匹配标准溶液响应/无基质标准溶液响应-1)×100。基质效应为负值表示存在基质抑制效应;基质效应为正值表示存在基质增强效应,0为无基质效应,绝对值越大，基质效应越强。按所述方法对5种基质中5种非法染料的基质效应进行评价。

1.2.9 实际样品的测定 在本文建立的试验条件下,对脐橙、蜜饯、火锅底料、辣椒油、香辣肉灌肠各10批次共50批次市售实际样品进行测定。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱解析及条件的优化 从图1的二级全扫描质谱图可以看到,在正离子模式下,柑橘红2号及苏丹红染料主要以[M+H]+离子形式存在。分析5种非法染料的碎片离子指纹图谱发现,这几种偶氮染料具有共同的几种碎裂方式,均易在偶氮处发生断裂而得到不同的碎片。首先,该类化合物母体骨架上的酚羟基容易断裂得到相应的碎片离子[M-OH+H]+;与萘母体上的偶氮在N=N处断产生具有母核碎片离子156[M-R]+和其取代基碎片离子,其中m/z 156碎片部分为偶氮染料的母体骨架部分,可以作为偶氮类染料的共同特征碎片;此外,Sudan Ⅲ和 Sudan Ⅳ在取代基上的偶氮结构仍可以发生断裂而得到不同的碎片;柑橘红2号在其取代基上的醚键也容易发生断裂掉甲氧基碎片,5种偶氮非法染料的二级全扫描质谱图见图1。为了同时满足定性定量的目的,MRM扫描模式下得到5种非法染料的一个母离子和两个子离子。

图1 柑橘红2号和苏丹红Ⅰ～Ⅳ的二级全扫描质谱图Fig.1 MS2 spectra of Citrus Red 2 and Sudan I～Ⅳ dyes注:A:柑橘红2号;B:苏丹红I;C:苏丹红Ⅱ;D:苏丹红Ⅲ;E:苏丹红Ⅳ。

2.1.2 色谱条件的优化 选用BEH C18色谱柱,分别以考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-10 mmol/乙酸铵溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液几种流动相条件下目标物的响应,结果发现，乙腈较甲醇作为流动相时，5种染料响应值增强,且峰形更好。而加入0.1%甲酸水溶液可以提高5种染料的离子化效率,并较好地改善峰形。最终确定采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。通过优化梯度洗脱程序,使目标物与杂质组分有效地分离,且峰形良好。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 样品提取剂的选择 考虑到5种偶氮染料的亲脂性特点和各种食品等基质较复杂等原因,采用乙腈提取,氯化钠盐析,一方面可以有效提高高油脂样品中偶氮染料的提取效率,另一方面对于含水较多的柑橘样品,可以促进目标物进入乙腈层,起到盐析的作用。本方法采用乙腈-氯化钠提取体系,氨基柱净化,较好地除去复杂基质中各种高油脂、高糖、高盐等杂质干扰,结合液相色谱-三重四级杆串联质谱,可达到检测要求。

2.2.2 前处理方式的选择 分别比较直接提取、中性氧化铝柱[18]和氨基柱三种前处理手段。在前处理过程中发现,对于高油脂等样品,直接提取和中性氧化铝柱不能很好地去除油脂,最后存在明显的油脂残留。此外,通过三种前处理方式的总离子流图(见图2)发现,直接提取方法干扰成分最多,中性氧化铝柱虽然起到了一定的净化效果,但是相比氨基柱还是要差一些。另一方面,对三种不同的前处理方式的基质效应进行评价(评价方法见1.2.8),发现中性氧化铝柱法基质效应与直接提取法相当(基质效应在60%以上),原因可能是,中性氧化铝法是采用非极性有机溶剂进行提取,对于高油脂样品中的油脂成分提取率过高,带来较严重的基质效应。通过乙腈提取后经过氨基柱净化，回收率满足要求,干扰物较少,基质效应小。氨基柱是以硅胶为基质的氨丙基萃取柱,在非极性有机溶剂中具有强的正相保留作用和弱的阴离子交换双重保留作用,特别适合于结构相近的化合物的净化。最终,选择氨基柱进行净化。

实验分别考察了在上样、淋洗等步骤目标物的保留情况,发现在上样阶段目标物即有10%左右的损失。因此本实验从上样开始收集,并用乙腈+二氯甲烷(1+99,体积比)继续洗脱两个柱体积(6 mL),结果目标物回收率满足要求,即洗脱完全。

2.2.3 样品除脂探索 对于高油脂样品辣椒油和火锅底料进行乙腈饱和正己烷脱脂步骤,结果发现，经正己烷脱脂步骤后,目标物回收率降低10%～20%。原因可能是,作为脂溶性较强的偶氮类染料易溶于正己烷,而导致一定的损失。因此,本实验不进行脱脂步骤。

2.2.4 定容体积 实验发现,随着定容体积的增大,基质效应逐渐减小,目标物响应值在定容体积由5 mL变为10 mL时基本没有变化,当定容体积增大到15 mL时开始有所降低。这是因为,增大定容体积,样品基质中杂质组分随之变小,使得基质效应明显降低,仪器响应提高。另一方面,随着定容体积增大,样品中目标物测试浓度降低。

表2 5种非法染料回归方程、决定系数、线性范围、检出限及定量限Table 2 Linear equation,determination coefficient,linear range,limits of detection and quantitation of five illegal dyes

图2 三种前处理方式下柑橘红2号和苏丹红I～Ⅳ的总离子流图Fig.2 TIC chromatograms of Citrus Red 2 and Sudan I～Ⅳdyes by three pretreatment methods注:A:直接提取;B:氨基柱净化;C:中性氧化铝净化。

因此本方法确定在2～40 ng/mL线性范围内定容体积为10 mL。但是,对于超出线性范围的阳性样品,可以根据需要增加稀释倍数。

2.3 线性范围、决定系数及定量限

将1.2.4步骤制备的标准工作溶液按浓度由低到高依次测定,以各物质定量离子对的峰面积(Y)对其质量浓度(X)作标准曲线,其线性决定系数均大于0.998。分别在空白基质中加10和5 μg/kg的目标物,按1.2.2前处理方法处理后,测试其信噪比,分别确定定量限和检出限。以信噪比S/N≥10得到目标物的定量限(LOQ),以信噪比S/N≥3得到目标物的检出限(LOD),结果见表2。

2.4 回收率和精密度

结果显示在阴性样品中添加10、50、100 μg/kg三个浓度水平的目标物,其加标回收率在80.7%～114%范围内,重复测定6次相对标准偏差均小于8.6%,如表3所示。所附的色谱图是选择基质复杂的辣椒油为代表,其空白样品及加标样品(10 μg/kg)的质量色谱图见图3。

2.5 基质效应评价

超高效液相色谱-串联质谱具有较高的灵敏度,但基于其检测原理,存在一定的基质效应,特别是对于油脂和蛋白含量高的等辣椒油和肉制品等样品会存在严重的基质效应。建立HPLC-MS/MS方法的同时对该方法的基质效应进行评价,同时采取一定的消除或减弱措施是十分必要的。

结果发现，在5类性质差异较大的基质中,柑橘红2号及苏丹红Ⅰ～Ⅱ的ME值基本在20%以下,基质效应影响较小;苏丹红Ⅲ和Ⅳ在蜜饯和辣椒油中存在一定的基质效应,见图6。鉴于对基质效应的考察,本实验采用基质匹配校正曲线定量(见1.2.5),以减少基质干扰对结果的影响。

图4 柑橘红2号和苏丹红Ⅰ～Ⅳ在5种食品中HPLC-MS基质效应评价图Fig.4 Matrix effects in HPLC-MS analysis of Citrus Red 2 and Sudan I～Ⅳ dyes in five matrics

2.6 实际样品测定

对50批次市售实际样品进行测定,包括脐橙、蜜饯(山楂卷)、辣椒油、火锅底料(红油半固体)及香辣肉灌肠等样品,均未检出含有5种非法染料。

表3 5种基质样品中5种非法染料添加回收率及精密度(n=6)Table 3 Average recoveries and RSDs of five illegal dyes in five sample matrices(n=6)

图3 辣椒油空白样品及加标样品(10 μg/kg)中五种非法染料的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatograms of five illegal dyes in chili oil注:A:空白样品;B:加标样品(10 μg/kg)。

3 结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中柑橘红2号和苏丹红染料的方法。采用乙腈提取,氨基固相萃取富集净化,高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测,建立了同时检测水果、果酱、辣椒制品、火锅底料及肉制品中柑橘红2号和苏丹红Ⅰ～Ⅳ 5种染料的方法。柑橘红2号和苏丹红Ⅰ～Ⅳ 5种非法染料在2～40 ng/mL范围内线性关系良好,决定系数(R2)为0.998,回收率在80.7%～114%之间,相对标准偏差RSD<8.6%。方法检出限为5.0 μg/kg,定量限为10.0 μg/kg,结果准确可靠,简单易行、灵敏度高、选择性好,能够满足多种食品中非法染料的食品监管需求,适用于食品中痕量水平的非法染料的定性、定量检测。