黑果枸杞总黄酮固体分散体的制备

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(新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐 830011)

黑果枸杞属茄科、紫黑色,果实里面含丰富的紫红色素,极易溶于水,属天然的水溶性花色甙黄酮类[1-2]。它生长在人类无法生存的荒山野岭、河床沙滩,拥有着极强的生命力,其中黄酮类化合物又称黄酮碱或黄酮,作为一种重要的多酚类天然产物,几乎存在于所有有色植物中,分布广泛,具有多种生物活性,即降血压、降血糖、抗肿瘤、调节免疫力、抗氧化、抗菌、保护心血管等功能[3-4]。但是黄酮为难溶于水的化合物,在溶液中难以形成维持有效浓度的释药速度,水溶性比较差,难以被胃肠道吸收,从而导致口服生物利用度低,在医疗使用上受到限制。据报道,40%新化学实体均为水难溶性或水不溶性物质,且高达50%药物因高疏水性而给制剂带来困难[5-6]。随着研究的深入,难溶性药物的开发和利用日渐增多,在提高难溶性药物溶出度和生物利用度等方面固体分散技术的优势将更为凸显。由于新载体材料和新制备方法取得长足进展,加上在缓控释制剂领域展现出广阔的应用前景,固体分散体必将在药剂学领域占据重要地位。因此通过制备黄酮固体分散体,黄酮在固体分散体中,以分子、无定形、微晶等形式处于高度分散状态,且因常采用PVPK-30等载体材料,增强了药物的可润湿性,因而可极大改善黄酮的溶出和吸收特性,提高其口服生物利用度[7-9]。

本实验采用性质优良的载体材料,通过单因素和正交试验设计筛选黑果枸杞总黄酮固体分散体的制备工艺参数,并进行物相鉴定,利用固体分散体技术改善黑果枸杞总黄酮在水中体外溶出行为,提高其生物利用度,为黑果枸杞类似产品的开发利用提供理论依据和实验基础,以达到保证疗效目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

黑果枸杞果实 紫黑色球状果实,采自于新疆阿克苏地区塔里木盆地;芦丁对照品 成都曼斯特生物科技有限公司,UV级,纯度为98.6%;聚维酮K-30(PVP-K30,白色粉末)、聚维酮K-15(PVP-K15,白色粉末)、聚乙二醇4000(PEG4000,白色粉末)、聚乙二醇6000(PEG6000,白色粉末)、普朗尼克F68 德国巴斯德国巴斯夫中国有限公司上海分公司,批号20161228;石油醚(60～90 ℃)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇(分析纯)。

CP225D电子天平 德国Sartorius公司;XL-02A型扣压式小型粉碎机 旭朗机械设备有限公司;数显恒温双头磁力搅拌器 金坛市金祥龙电子公司;UV-9100型紫外可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司;RCZ-6B2药物溶出度仪 上海黄海药检仪器公司;KQ3200B超声波清洗器 昆山市超声仪器公司;XRD-6000 X射线衍射仪 日本岛津;TGA1000热重分析仪 上海盈诺精密仪器有限公司;SIGMA 500扫描电镜 德国卡尔蔡司公司;FDU-2100实验室小型-80 ℃冷冻干燥机 日本东京理化器械株式会。

1.2 实验方法

1.2.1 黑果枸杞总黄酮的制备 将采集的黑果枸杞清洗后在(105±2) ℃干燥至恒重,用粉碎机粉碎并过40目筛子,索氏提取器用石油醚脱脂6.0 h,50 ℃烘箱干燥2.0 h后备用。精密称取脱脂后黑果枸杞粉0.5 g,在黑果枸杞粉和50%乙醇溶液按照1∶5 g/mL比例、超声功率为70 W、超声温度60 ℃条件下提取15 min,在3000 r/min离心10 min。离心后的提取液在0.2 MPa,50 ℃条件下减压浓缩,采用真空干燥箱在50 ℃条件下干燥,获得黑果枸杞总黄酮干燥物[10-11]。

1.2.2 黑果枸杞总黄酮含量测定

1.2.2.1 检测波长的确定 精密称取真空干燥后黑果枸杞总黄酮10 mg置100 mL容量瓶中,加入50%乙醇溶解并稀释至刻度。精密量取1.0 mL黄酮溶液置于100 mL容量瓶中,并按照硝酸铝显色法显色[12],再用0.45 μm微孔滤膜过滤,在400～700 nm波长范围内进行扫描,黑果枸杞总黄酮在510 nm处有最大吸收,而此处PVP-K30、PVP-K15、PEG6000、PEG4000、F68无吸收干扰,所以选择510 nm为测定波长。

1.2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品20 mg置10 mL容量瓶中加50%乙醇稀释至刻度,配制成2 mg/mL的标准储备液。分别精密量取储备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置25 mL容量瓶中,加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL,摇匀放置5 min,加10%硝酸铝溶液1.0 mL,摇匀放置5 min,加4%氢氧化钠溶液10 mL,加50%乙醇溶液至刻度,摇匀放置15 min,以相应的试剂溶液为空白,在510 nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度(C,mg/mL)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线,其回归方程和相关系数为:C=9.493A+0.044,R=0.9993,标准曲线具有良好的拟合性。

1.2.3 固体分散体的制备

1.2.3.1 熔融法制备固体分散体 精密称取PVP-K30、PVP-K15置于烧杯中,在65 ℃水浴加热其熔融,加入黑果枸杞黄酮粉末,边加边搅拌,使黄酮完全融于载体中,继续搅拌45 min。然后从水浴中取出,放入预冷的托盘中,在冷阱温度-80 ℃,真空度2.0 Pa,最大加热板温度25 ℃条件下真空冷冻干燥28 h,得到黑果枸杞黄酮固体分散体。将干燥物从托盘中取出,研碎,过80目筛,置干燥器避光保存[13-14]。

1.2.3.2 溶剂法制备固体分散体 精密称取PEG4000、PEG6000、F68与黑果枸杞总黄酮粉于烧杯中,加入50 mL无水乙醇溶解,置于磁力搅拌器中搅拌,直至总黄酮粉和载体均溶解成澄明液体,继续搅拌至45 min,减压蒸发至黏稠时,迅速倒入预冷的托盘中,其他操作同上1.2.3.1[15-16]。

1.2.3.3 物理混合物的制备 为验证固体分散体是否形成,制备黑果枸杞总黄酮与PVP-K30、PVP-K15、PEG4000、PEG6000、F68的物理混合物。精密称取黑果枸杞总黄酮粉末与不同载体,置研钵中研细,过80目筛,装于自封袋内,振摇5 min,混合均匀后即得不同载体的物理混合物,封口避光保存备用。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 载体材料的选择 以累积释放百分率为考察指标,分别选择PEG4000、PEG6000、PVP-K15、PVP-K30、泊洛沙姆为载体材料,原料与载体按照1∶3的比例,搅拌45 min,分别采用上述溶剂法和熔融法制备固体分散体,筛选适宜的载体材料。

1.2.4.2 原料与载体材料比例的筛选 以累积释放百分率为考察指标,分别选择原料与载体比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的比例,PVP-K30为载体材料,搅拌45 min,分别采用上述溶剂法和熔融法制备固体分散体,筛选适宜的原料与载体材料的比例。

1.2.4.3 搅拌时间的筛选 以累积释放百分率为考察指标,PVP-K30为载体材料,按照1∶3比例,分别搅拌30、45、60、75、90 min,分别采用上述溶剂法和熔融法制备固体分散体,筛选适宜的搅拌时间[17-18]。

1.2.5 正交试验 根据单因素实验结果,以累积释放百分率为考察指标,采用L9(34)正交实验设计,筛选黑果枸杞总黄酮固体分散体制备工艺参数[19],正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 指标的测定

采用《中国药典》2015年版二部附录“溶出度测定法”规定的转篮法测定溶出度。溶出介质:采用盐酸(0.1 moL/L盐酸,含0.2%十二烷基硫酸钠)为溶出介质,体积900 mL;温度:(37±0.5) ℃;转速:100 r/min。分别于0、3、6、9、12、15、30、45、60 min时取样5 mL,0.45 μm微孔滤膜过滤,同时向溶出液中补充新鲜介质5 mL。量取续滤液,按照硝酸铝显色法显色方法,在510 nm测定吸光度A,根据标准曲线计算黄酮的浓度,折算成溶出度,按照下面公式计算其累积释放百分率[20-23]:

1.4 固体分散体的物相鉴定

1.4.1 扫描电镜 精密称取少量固体分散体、PVP-K30、黄酮、物理混合物样品涂布在带有双面黏附胶的玻璃片上,操作电压为20 kV,并在氩气环境下喷金,采用SEM观察不同样品粒子表面的微观形态。

1.4.2 XRD分析 分别对黑果枸杞总黄酮、PVP-K30、物理混合物及固体分散体进行粉末XRD。工作参数:使用CuKa靶射线为发射源,电压40 kV:电流100 mA:扫描速度8 °/min,扫描范围10～80 °。取约待测样品粉末50 mg,压成薄片后测定。

1.4.3 热重(TGD)分析 黑果枸杞总黄酮、PVP-K30、物理混合物及总黄酮固体分散体适量,分别置于TGA的铝盘中,以氧化铝为参比物,升温速度10 ℃/min,升温范围0～700 ℃,横坐标为温度,纵坐标为失重百分数表示,在氮气环境下测定其热曲线。

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 载体类型的选择 由图1可知,黑果枸杞总黄酮固体分散体累积释放百分率均明显高于原料药和物理混合物,15 min时达到最高,基本达到平衡。到30 min时,PVP-K30、PEG8000、F68三种载体为主的固体分散体累积释放百分率分别达到80.2%、62.3%、65.4%,而原料药仅有20.3%,固体分散体的溶出速度比黄酮高出3～4倍,其中PVP-K30效果较佳,原因可能是PVP-K30粘度增大而抑制药物晶核的形成及成长,使药物呈无定形态,从而增加其在水中的溶解度。于对于难溶性药物而言,利用水溶性载体制备的固体分散物,PVPK30可以提高黑果枸杞总黄酮的润湿性,在分散体中总黄酮分子被载体分子包围,与水接触后,载体分子迅速溶解,药物润湿,从而增加了溶出速率。另外载体可以使总黄酮保持高度分散状态,药物成分散状态而不聚集成,从而增加了药物的溶出度。

图1 载体类型对黑枸杞总黄酮固体分散体累积释放百分率的影响Fig.1 Effect of carrier type on total dissolution percentage of total flavonoids of black fruit Lycium barbarum

2.1.2 原料与载体材料比例的筛选 由图2可知,原料药和载体比例在1∶2、1∶3、1∶4时,30 min时累积释放百分率分别可以达到75.6%、86.4%、78.6%,比黄酮的累积释放百分率高出4倍。其中PVP-K30与黄酮比在1∶3时所形成固体分散体累积溶出百分率较高,达到86.4%。虽然物理混合物的累积释放百分率比原料药有所提高,但是低于载体和黄酮形成的固体分散体的累积释放百分率,原因是物理混合物只能是载体的增溶,而固体分散体的增溶来自于高分散性、粒径、晶型的综合作用。载体的固体分散体,药物在固体分散体中高度分散、形成一种固体形式存在的分散系统,载体在其中起到阻延药物结晶和增加药物可湿性的作用。

图2 原料药与载体比例对黑枸杞总黄酮固体分散体累积溶出百分率的影响Fig.2 Effect of proportion of raw material medicine on total dissolution percentage of total flavonoids of black fruit Lycium barbarum

2.1.3 搅拌时间的筛选 由图3可知,随着搅拌时间的延长,固体分散体累积释放百分率逐渐增加均高于黄酮和物理混合物,搅拌时间分别为45、60、75 min时达到最高即72.0%、80.9%、89.1%。再次延长搅拌时间,累积溶出百分率反而有下降趋势,其原因主要为随着搅拌时间的延长黄酮均匀分散在载体中溶解度增加,但是溶出一定时间后趋于过饱和状态,黄酮累积释放百分率降低,其中搅拌时间在75 min时,30 min内其累积溶出百分率可达到89.1%,而90 min时累积溶出百分率为63.9%,比30 min还低,因此分别取45、60、75 min进行正交试验。

图3 搅拌时间对黑枸杞总黄酮固体分散体累积溶出百分率的影响Fig.3 Effect of mixing time on total dissolution percentage of total flavonoids of black fruit Lycium barbarum

2.2 正交试验结果

根据单因素实验结果,选取载体的类型、原料与载体的比例、搅拌时间进行三因素三水平的正交试验,试验结果(表2)可以看出,载体的类型,原料药与载体的比例对黑枸杞总黄酮固体分散体的累积溶出百分率产生不同程度的影响,而且影响显著(p<0.05),各因素对黑枸杞总黄酮固体分散体的累积溶出百分率影响主次序为B>A>C,最佳工艺组合为A1B2C3,即载体为PEG6000、比例为1∶3、搅拌时间为75 min。在此结果上,进一步进行验证试验,黑枸杞总黄酮固体分散体的累积溶出百分率可达到90.3%,为黑果枸杞总黄酮固体分散体的制备工艺最佳条件,正交试验结果及方差分析见表2、表3。

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis results

2.3 固体分散体的物相表征

2.3.1 扫描电镜 结果显示四种不同样品表面结构完全不同。黑果枸杞总黄酮和PVP-K30以大小不一的结晶体存在,而固体分散体中没有明显晶体存在,表明药物在PVP作用下形成共沉淀物以无定形形式存在,形成固体分散体。物理混合物可以看出是多种物质的简单混合状态,即有晶体又有粉末,结果见图4a～图4d。

图4 扫描电镜图Fig.4 SEM picture注:a:固体分散体扫描电镜图;b:PVP-K30扫描电镜图;c:黑果枸杞总黄酮扫描电镜图;d:物理混合物扫描电镜图。

2.3.2 XRD分析 X-射线衍射扫描图谱结果见图5(a～d),图5a为黑果枸杞总黄酮XRD图,在10～30 °有2个衍射峰,图5b为物理混合物的XRD图,在10～30 °有2个衍射峰,是黑果枸杞总黄酮和PVP-K30各自谱线的叠加,药物特征晶体峰仍明显存在,但强度减弱。图5c为PVP-K30的XRD图,也有2个衍射峰,第一个衍射峰强度增加,而图5d为黑果枸杞总黄酮固体分散体的XRD图,2个衍射峰合为较宽的一个衍射峰,说明黑果枸杞总黄酮熔在载体材料中,药物吸收峰被掩盖,说明制成固体分散体以后,总黄酮在固体分散体中以无定形态存在,这为其溶解度和溶出度的提高提供了依据。

图5 X-射线衍射扫描图谱Fig.5 X-ray diffraction scan 注:a:总黄酮;b:物理混合物;c:PVP-K30;d:固体分散体。

2.3.3 热重(TGD)分析 TGA图6(a～c)显示,黑果枸杞总黄酮、PVP-K30、物理混合物在50～450 ℃范围内稳定,温度高于450 ℃时开始分解。而TGA图6d显示,在150 ℃左右热稳定性下降,是由总黄酮与载体材料以适当比例混合,形成共沉淀无定形物,有时称玻璃态固熔体,分子进入PVP分子的网状骨架中,药物晶体受到PVP的抑制而形成非结晶性无定形固体分散体,固体分散体热熔温度下降,可以提高黄酮溶出速度。

图6 热重分析图Fig.6 Thermogravimetric analysis注:a:总黄酮;b:物理混合物;c:PVP-K30;d:固体分散体。

3 结论

本研究在试验过程中对总黄酮中间体性质也进行考察,过程中发现中间体总黄酮难溶于水,属于难溶性药物。若将提取物总黄酮直接口服给药将影响药物的生物利用度,不能正常的发挥药效。在制剂过程中,考虑采用固体分散技术来提高难溶性药物的溶解性能,增加药物的溶解速度及溶出速率,改善药物的吸收及生物利用度[24-25],所以本研究以黑果枸杞总黄酮为原料,以PEG6000为载体制备固体分散体,按照1∶3比例采用溶剂法制备黑果枸杞总黄酮固体分散体,原料药在60 min时累积释放百分率仅有20.3%左右,而固体分散体30 min就可以达到89.3%。而且本实验所用黑果枸杞的研究比较少,并没有成品用于临床和实际应用,在市面上未见类似产品。

因此通过上述研究可以为进一步开发研究黑果枸杞新产品,加快黑果枸杞精深加工发展步伐,进一步促进现代黑果枸杞中药材研究开发、生产制造新药开发及中药现代化的发展提供理论依据和试验基础。