不同品种苹果多酚体外抗氧化能力评价

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(河南科技学院食品学院,河南省高校重点实验室培育基地, 新乡市农产品加工工程技术研究中心,河南新乡 453003)

苹果多酚是苹果中多元酚类化合物的总称,具有多种生理功能[1-3],在人类健康方面具有预防癌症、预防高血压、预防冠心病、抗菌消炎等作用[4-7]。苹果中的多酚种类、含量与苹果品种、成熟期、生态环境等因素密切相关[8-9],研究表明不同成熟期金冠(Golden Delicious)苹果中绿原酸含量变化明显,在苹果生长中期绿原酸含量最高,到成熟期绿原酸含量降至50%[10];在酿酒苹果皮中黄烷三醇类多酚含量较低,在果肉中含量较高[11]。苹果多酚电位低,分子内部含有大量的酚羟基,而酚羟基能够提供大量活性很强的氢质子,从而将活泼的单线态氧还原成稳定的三线态氧,减少氧自由基的产生[12];苹果多酚在有氧化酶的体系中可以抑制氧化酶的活性,间接的清除各种自由基[13],所以苹果多酚作为一种高抗氧化活性物质能够应用于食品工业[14],比如防止食品变质,减少维生素氧化等。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果 于2017年采摘于河南省郑州市中国农科院郑州果树所实验基地,采摘的样品置于4 ℃冷藏,一周内完成分析。供试的苹果来源如表1所示;原儿茶酸、儿茶素、花青素B2、表儿茶素、鞣花酸、槲皮素和根皮苷 购自Sigma-Aldrich;没食子酸、绿原酸、金丝桃苷、咖啡酸 购于成都曼斯特有限公司;乙酸 分析级,购自科密欧化学试剂公司;甲醇 色谱级,购自Tedia;DPPH自由基醇溶液、Tris-HCl 缓冲液(pH8.2)、磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH6.6)、乙醇、Folin-Ciocalteu试剂 购自北京索莱宝公司;碳酸钠、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、邻苯三酚、HCl、H2O2、FeSO4、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3等 均为分析纯，购自西陇化工公司。

表1 13种苹果来源Table 1 Source of thirteen varieties apples

QBS-80型汽爆工艺试验台 河南鹤壁正道重型机械厂;FW-400A高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;SIGMA3-30K离心机 德国SIGMA公司;RP1000910059可见分光光度计 尤尼柯上海仪器有限公司;ALPHA 2-4真空冷冻干燥室 德国CHRIST公司;7DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;XJ220A型分析天平 上海精科天美科学仪器有限公司;KH-100V型超声波提取仪 昆山禾创(上海)仪器有限公司;R-1005型旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司;Waters高效液相色谱,含1525二元泵,2998双通道紫外检测器,2707自动进样器,Breeze色谱管理软件等 美国Waters公司;Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苹果的预处理 取100 g苹果皮(约1 mm)在热风干燥箱中干燥,温度45 ℃,时间2 h,得到苹果渣并置于封口袋中保存备用。

1.2.2 苹果多酚的提取 取干燥后的苹果渣在蒸汽压力0.6 MPa爆破120 s,在500 mL三角瓶中加入10 g爆破处理得到的苹果渣、200 mL 70%的乙醇和0.1 g抗坏血酸,搅拌均匀后置于80 Hz超声波(100 W,40 ℃)条件下萃取15 min,然后将萃取液置于砂芯过虑得到第一次提取液,收集滤渣加入100 mL 70%的乙醇重复上述操作,合并提取液,在50 ℃条件下旋蒸浓缩至30 mL,即得到苹果多酚提取液[25]。

1.2.3 苹果多酚浓度测定 采用优化的福林酚法[25]测定苹果多酚含量。准确称量1 mg没食子酸溶于10 mL 70%乙醇作为母液。取9支100 mL的容量瓶,分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL上述标准液,添加5 mL Folin-Ciocalteu试剂,50 mL蒸馏水,摇匀后加15 mL浓度为1 mol/L的Na2CO3溶液,用蒸馏水定容至刻度,并于室温避光反应2 h后,在765 nm下测定吸光度,以吸光度为纵坐标,没食子酸浓度为横坐标绘制标准曲线,并进行线性回归分析。标准曲线的回归方程为:y=0.1208x+0.0021,R2=0.9980。式中,y为吸光度,x为没食子酸的浓度,μg/mL。将多酚提取液代替没食子酸溶液按照上述方法测定吸光度,根据标准曲线计算苹果多酚浓度。

1.2.4 苹果多酚种类及单体酚含量的测定 取30 mL 1.2.2步骤得到的多酚提取液，旋蒸浓缩,用甲醇定容至10 mL。采用前期建立的HPLC方法[26]进行多酚种类的测定,Waters 2695系统,C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)反相色谱柱,流动相分别是1%(V/V)乙酸水溶液(A)和色谱甲醇(B),梯度洗脱程序:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%～50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70%～5% B。柱温常温,流速1.0 mL/min,上样量20 μL,检测波长280 nm和320 nm。利用前期建立的各标品标准曲线计算单体酚的含量[26]。

1.2.5 抗氧化能力的测定

1.2.5.1 DPPH·的清除效果测定 采用Musa[27]的方法:将2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·醇溶液加入到2 mL 1.2.2得到的多酚提取液中。用力振摇混匀后置暗室中静置30 min,于517 nm测定吸光度值。以不加样品作为空白对照。按式(1)计算DPPH·清除率。将单体酚溶液(浓度1 mg/mL)取代多酚提取液按照上述方法测定DPPH·清除率。

式(1)

式中,A0-空白对照液的吸光度,Ax0-样品溶液本底的吸光度,Ax-样品溶液的吸光度。

式(2)

式中,A0-空白对照液的吸光度,Ax0-样品溶液本底的吸光度,Ax-样品溶液的吸光度。

式(3)

式中,A0-空白对照液吸光度,Ax0-样品溶液本底的吸光度,Ax-样品溶液的吸光度。

1.2.5.4 ·OH清除效果测定 采用Rajauria[30]的方法:在1 mL 1.2.2得到的多酚提取液中加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L),最后加1 mL H2O2(8.8 mmol/L)在37 ℃反应30 min,在510 nm下测定吸光度。以相同体积蒸馏水代替样品作为空白对照组。以1 mL样品溶液中、1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)和1 mL 蒸馏水混合液的吸光值作为样品的本底吸收值。按下式计算·OH清除率。将单体酚溶液(浓度1 mg/mL)取代多酚提取液按照上述方法测定·OH清除率。

式(4)

式中:A0-空白对照液的吸光度;Ax-样品溶液的吸光度;Ax0-样品溶液本底的吸光度。

1.2.5.5 总还原能力测定 总还原能力测定采用Ozyurt[31]方法进行:l mL蒸馏水中加入0.2 mL 1.2.2得到的多酚提取液、2.5 mL磷酸缓冲液混合(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL 1%的铁氰化钾,置于50 ℃反应20 min,再加1 mL 10%三氯乙酸,离心10 min(3000 r/min),取上清液2.5 mL加2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1% FeCl3,在700 nm 处测定吸光度。吸光度越高,说明样品还原性越强。将单体酚溶液(浓度1 mg/mL)取代多酚提取液按照上述方法测定总还原能力。

1.3 数据处理

每组数据测定三次,用平均值±标准差表示,用SPSS(18.0)软件进行数据分析,采用tukey法进行显著性检验(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同品种苹果多酚含量

按照1.2.2所述方法,采用爆破处理苹果渣,超声波辅助溶剂提取苹果渣多酚。根据1.2.3建立的标准曲线计算苹果多酚提取液的含量,结果如表2所示。不同品种苹果中多酚含量有显著差异(p<0.05)。新疆高酸品种红勋一号多酚含量最高,达到5.35 mg/g,红盖露中多酚含量最低(2.05 mg/g),颜色较深的红勋一号、蜜脆、澳洲青苹、茂汶、富士、新疆二号等苹果多酚含量较高,颜色较浅的爵士、红盖露、皮诺娃等苹果多酚含量较低。说明多酚含量与苹果品种有一定的关系,这与已有研究结果类似[9]。

表2 13种苹果多酚含量Table 2 Polyphenols content of thirteen varieties apples

2.2 不同品种苹果多酚种类及含量

将13种苹果多酚提取液进行HPLC分析[25],测定结果如表3所示。

在检测的13种苹果中,红勋一号是总多酚含量最高的品种,与其他单体酚相比,红勋一号中金丝桃苷、花青素B2和鞣花酸是10种单体酚中含量较高的单体酚,而咖啡酸和槲皮素是10种单体酚中较低的单体酚,与其他品种苹果相比,红勋一号中金丝桃苷和花青素B2的含量是13个苹果品种中最高的单体酚,而槲皮素和根皮苷是13个苹果品种中较低的单体酚;红盖露是总多酚含量最低的品种,与其他单体酚相比,红盖露中金丝桃苷、鞣花酸和表儿茶素是10种单体酚中含量较高的单体酚,而咖啡酸和原儿茶酸是10种单体酚中含量较低的单体酚,与其他品种苹果相比,红盖露中表儿茶素和金丝桃苷是13个苹果品种中较高的单体酚,而原儿茶酸和根皮苷是13个苹果品种中较低的单体酚;综合比较发现在13种苹果中鞣花酸、绿原酸、表儿茶素的含量相对较高,儿茶素、咖啡酸、原儿茶酸的含量相对较低,单体酚测定结果Urska等[9]的研究结果接近。不同品种苹果单体酚的含量相差较大,有显著性差异(p<0.05)。同一品种单体酚总量与总酚含量也有差异,是因为建立的HPLC方法检测出了大部分含量较高的单体酚,个别含量低的单体酚没有检测出来。为了进一步研究各单体酚和总酚抗氧化活性之间关系,需要对各单体酚进行抗氧化活性测定。

2.3 不同品种苹果多酚提取液体外抗氧化活性

图1 13种苹果总酚抗氧化能力Fig.1 Total polyphenols antioxidation activity of thirteen varieties apples注:1.皮诺娃;2.长富二号;3.爵士;4.茂汶;5.凉香;6. 凯蜜欧;7. 富士一系;8. 新疆二号;9. 红盖露;10. 玉华早富;11.澳洲青苹;12.红勋一号;13.蜜脆。

2.4 不同单体酚抗氧化活性

13种苹果均检测到10种单体酚,将各单体酚标品配制成含量为1 mg/mL的溶液,按照1.2.5方法对10种单体酚分别进行体外抗氧化活性测定,结果如图2所示。

图2 10种单体酚抗氧化能力Fig.2 Antioxidation activity of ten free phenols注:1.原儿茶酸;2.儿茶素;3.表儿茶素;4.根皮苷;5.绿原酸;6. 咖啡酸;7. 鞣花酸;8. 原花青素B2;9. 金丝桃苷;10. 槲皮素。

3 结论

利用蒸汽爆破联合超声波辅助萃取苹果多酚并综合评价了13种苹果总多酚体外抗氧化活性,发现13种苹果多酚提取液均有抗氧化活性,但是有一定差异,通过比较说明不同品种苹果多酚抗氧化活性与多酚含量没有明显的相关性;通过单体酚的检测发现鞣花酸、表儿茶素和绿原酸含量较高的皮诺娃、长富二号、凯蜜欧、红盖露和玉华早富5种苹果多酚提取液综合抗氧化能力较强,从而证明不同品种苹果多酚抗氧化能力与单体酚含量有相关性。通过上述结论对不同品种苹果多酚抗氧化活性进行综合分析揭示了单体酚和总酚抗氧化活性之间的关系,为进一步研究苹果多酚功能活性提供研究基础,对不同苹果多酚的应用具有指导作用。