提取温度对罗非鱼皮明胶理化性质的影响

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(1.海南大学食品学院,海南海口 570228; 2.海南大学热带生物资源教育部重点实验室,海南海口 570228)

明胶是纤维状胶原蛋白大分子在一定条件下部分水解的产物[1],因其具有良好的流变性、乳化性、成膜性等优良品质,常作为澄清剂、胶凝剂被广泛应用于食品、医药等工业生产中[2]。近年来，全球对于明胶的需求持续增长,2011年全球明胶产量已达34.89万吨,预计到2018年将达45.07万吨[3]。然而,传统上的明胶一般是由陆栖动物的皮和骨骼制备而成,由于疯牛病和口蹄疫的出现以及一些宗教的限制,近些年来对水产源明胶的研究广受研究者的关注。

罗非鱼,又称非洲鲫鱼,被誉为未来动物性蛋白主要来源之一,近年来我国罗非鱼的出口增值率一直居世界首位[4]。而罗非鱼加工业产生的大量鱼皮、鱼鳞等下脚料所占比重高达原材料的20%～30%[5-6],其中鱼皮胶原蛋白含量丰富。因此,有效地把鱼皮用作明胶的生产,不仅可以节约资源减轻污染,而且可以带来巨大的经济效益。

胶原蛋白受热变性即可衍生成明胶,胶原蛋白转变为明胶包含两个过程:一是蛋白的变性,即胶原蛋白受热分解,螺旋结构解链;二是共价交联的水解过程,胶原蛋白分子在酸、碱、酶的作用下交联键部分裂解,胶原蛋白转化为可溶性明胶[7]。而胶原蛋白转化为明胶的程度与许多因素有关,如提取温度、pH等。温度是提取明胶过程中一个非常重要的参数,不仅影响得率,对明胶的性质也有一定影响[8-9]。目前还没有关于提取温度影响罗非鱼皮明胶性质方面的相关研究。因此,本实验以罗非鱼皮为原料,探讨提取温度对明胶的得率、凝冻强度、分子质量、热变性温度和流变性能等性质的影响,旨在有效利用鱼皮资源,并为罗非鱼皮明胶的产业化生产提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼皮 海南翔泰渔业股份有限公司(冷冻储存时间不超过90 d);异丙醇、氯化钠、盐酸 广州化学试剂厂;十二烷基磺酸钠、Tris-HCl、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED) 碧云天生物科技有限公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白质标准品 美国赛默飞世尔科技有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

JS-Ⅲ冻力测试仪、HW-Ⅲ恒温水箱、ZL-Ⅲ制冷机 天津旭阳仪器设备有限公司;EYEL4 Mpdel冷冻干燥机 日本TOKYO RIKAKIKAI公司;DSC131EV差示扫描量热仪 法国塞塔拉姆仪器公司;DYCZ-24DN垂直电泳系统 北京市六一仪器厂;TV-1900双光束紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器公司;Stratos高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司;DISICOVERY HR-2流变仪 美国TA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗非鱼皮预处理 罗非鱼皮解冻去鳞、去骨,并用刀刮除表面脂肪,剪成1 cm×1 cm的碎片,洗净沥干后,4 ℃条件下于体积分数20%异丙醇中萃取24 h脱脂,水洗充分沥干,置于质量分数为5%的氯化钠溶液(1∶20,m/V)中浸泡,并连续搅拌12 h以去除鱼皮中的杂蛋白,2 h换一次液,去离子水漂洗后沥干。

1.2.2 罗非鱼皮明胶的提取 预处理的罗非鱼皮与0.2 mol/L 盐酸溶液以1∶5的比例混合浸泡30 min,水洗pH至4～5,以1∶10 (m/V)的比例添加去离子水在不同温度(30、40、50、60、70、80、90 ℃)水浴抽提5 h,10000 r/min离心10 min,纱布过滤后于-50 ℃冷冻干燥48 h得到成品明胶。

1.2.3 罗非鱼皮明胶得率的计算 根据冷冻干燥后的鱼皮及鱼皮明胶的重量,按照以下公式计算得率。

1.2.4 罗非鱼皮明胶的SDS-PAGE分析 参考Hao等[10]采用的直板电泳方法,分析鱼皮明胶的分子量分布,称取一定量明胶样品,溶解于去离子水中配制5 mg/mL的鱼皮明胶溶液。配制5%的分离胶和4%的浓缩胶,采用不连续的Tris-甘氨酸电泳系统,在80 V稳流电压的条件下进行分析,电泳时间约1.5 h。电泳结束后,考马斯亮蓝染色液染色2 h,脱色后于凝胶成像系统中拍照分析。

1.2.5 罗非鱼皮明胶凝冻强度的测定 参考陈小雷[11]的方法,配制质量分数6.67%的明胶溶液,于(10±0.5) ℃条件下放置成熟16～18 h后,用探头直径为12.7 mm的冻力仪进行测定,下压高度为4 mm,下压速率1 mm/s。选取多个位置进行凝冻强度的测定,平行测定3次,计算平均值。

1.2.6 罗非鱼皮明胶的紫外吸收光谱扫描 鱼皮明胶的紫外吸收光谱扫描参考赵苍碧等[12]的方法,并适当修改。取适量明胶样品,配制成浓度为1.0 mg/mL的明胶溶液。在190～400 nm波长范围内对明胶溶液进行紫外吸收扫描,以去离子水为对照,分辨率为0.5 nm。

1.2.7 罗非鱼皮明胶的傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)分析 根据Muyonga等[13]的方法,取2 mg明胶样品与适量溴化钾粉末,在干燥条件下置于玛瑙研钵中充分研磨后手动压片,置于样品室内进行分析。红外光谱扫描范围为4000～500 cm-1,分辨率为2 cm-1。

1.2.8 罗非鱼皮明胶热变性温度的测定 称取明胶样品8～10 mg于铝锅中,加盖密封后置于差示扫描量热仪的样品槽中进行分析,扫描温度为30～130 ℃,升温速率为10 ℃/min。

1.2.9 罗非鱼皮明胶的流变学特性分析 参考Dileep等[14]的方法,采用DHR-2流变仪测定质量分数为6.67%的明胶溶液的弹性模量(G′)和黏性模量(G″)的流变学曲线,扫描温度为20 ℃,剪切频率为0.01～10 Hz。

2 结果与分析

2.1 提取温度对罗非鱼皮明胶得率的影响

如图1所示,提取温度从30 ℃上升到90 ℃时,明胶得率随温度的升高而增加,这一结果与大西洋鲑鱼皮[15]和波罗的海鳕鱼骨骼、三文鱼鱼皮[13]的结果一致,但在提取温度为60～80 ℃时,温度对于明胶得率无显著影响(p>0.05)。当提取温度为90 ℃时，明胶提取率达到最大，为62.60%±0.84%。更高的提取温度可以提供更高的能量破坏皮肤中胶原蛋白的氢键[16],因此,随着提取温度的升高,胶原蛋白分子内及分子间的化学键断裂的更多、更彻底,致使胶原蛋白变性到更高的程度,明胶的得率升高。

图1 提取温度对罗非鱼鱼皮明胶得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of gelatin from tilapia skin注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05),下同。

2.2 罗非鱼皮明胶的SDS-PAGE分析

由图2可知,提取温度为30、40、50 ℃时,明胶亚基结构保持比较完整,由α1、α2、β3条肽链组成,提取温度为60 ℃时,明胶分子断裂成更小的片段,分子质量下降,电泳条带开始模糊;提取温度为70、80、90 ℃时,电泳条带不明显。提取温度较低时,明胶分子少数螺旋结构发生解体,大分子组分无法溶出;适当升温时,较多的胶原化学键被破坏,释放出更多大分子亚基;温度过高导致胶原螺旋结构过度解体,明胶分子断裂成更小的片段[17],分子质量过低无法在图谱中显示。

图2 不同提取温度提取的罗非鱼鱼皮明胶的SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE patterns of gelatin from tilapia skin at different extraction temperatures

2.3 提取温度对罗非鱼皮明胶凝冻强度的影响

凝冻强度是衡量明胶质量优劣的一个重要指标。由图3可知,凝冻强度随提取温度的升高先增大后减小,在50 ℃凝冻强度达到最大值(884.33±26.76) g,在90 ℃获得最低的凝冻强度,这一结果与白鲢鱼皮明胶[17]接近,方差分析结果表明,提取温度对于明胶的凝冻强度有显著影响(p<0.05)。

图3 提取温度对罗非鱼鱼皮明胶凝冻强度的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the gel strength of gelatin from tilapia skin

明胶的凝冻强度主要与明胶的亚氨基酸、羟脯氨酸含量及分子量分布有关。明胶中亚氨基酸含量越高,凝冻强度越大。提取温度较低时,只有部分氢键被破坏,明胶三螺旋结构保持较完整。适当升温,胶原螺旋解体暴露出更多的极性基团,释放出更多明胶大分子亚基(尤其是α组分),明胶分子与水分子充分结合,致使明胶的分子链变长,网状结构更坚固,形成的胶凝体的凝冻强度越大[17]。提取温度过高时,胶原亚基组分被降解,明胶分子链变短,形成的胶凝体内部作用力变小,明胶的凝冻强度降低[18]。因此,低水解的明胶可能含有更长的链,链与链之间更容易交互形成强大的网状结构从而得到更高的凝冻强度。

2.4 提取温度对罗非鱼皮明胶紫外吸收光谱的影响

由于蛋白质分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸,在250～290 nm范围内有最大吸收。但明胶中含有少量的芳香族氨基酸,使其在这个范围内基本无吸收峰。而明胶肽链存在C=O、-CONH2、-COOH 等生色基团,所以紫外吸收峰通常会出现在220 nm左右[19]。如图4所示,不同提取温度下提取的明胶溶液紫外吸收区范围在190～230 nm内,紫外吸收峰都在208 nm左右,与陈小雷[11]的结果类似,这是肽键中酰胺键的特征吸收峰,是蛋白质的共有特性[20]。由图4可以看出,提取温度对于罗非鱼皮明胶的紫外吸收光谱的影响很小,几种鱼皮明胶的紫外吸收峰峰形一致,峰值大小有微小区别。

图4 提取温度对罗非鱼鱼皮明胶的紫外吸收光谱的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the ultraviolet absorption of gelatin from tilapia skin

2.5 提取温度对罗非鱼皮明胶红外光谱性质的影响

由图5可知,不同温度下提取的明胶样品各峰形一致,均具有蛋白质特征的酞胺带吸收和侧链基团吸收的特征峰,即酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰。不同温度下提取的鱼皮明胶的酰胺A谱带出峰位置都在3433.96 cm-1左右,而这个谱带主要是由N-H的伸缩振动或O-H的伸缩振动引起的。酰胺I谱带出峰位置都在1653.62 cm-1左右,符合酰胺I带的常见频率范围(1600～1700 cm-1),该谱带主要与多肽主链上的羰基(C=O)伸缩振动有关[21-22]。酰胺Ⅱ带的吸收峰出现在1547 cm-1左右,是由C-H振动或N-H振动引起的[23]。酰胺Ⅲ的吸收峰通常位于1300～1200 cm-1这部分结构与胶原蛋白的三螺旋结构的完整性有关[24]。提取温度为30、40、50、60 ℃时,鱼皮明胶在1240 cm-1处出现酰胺Ⅲ带的吸收峰,而提取温度为70、80、90 ℃时,酰胺Ⅲ 带在1238 cm-1处出现吸收峰,而罗非鱼皮胶原蛋白的酰胺Ⅲ带吸收峰位于1240cm-1处[25],说明提取温度较高时三螺旋结构部分破坏。

图5 提取温度对罗非鱼鱼皮明胶的红外性质的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the FTIR spectra of gelatin from tilapia skin

2.6 提取温度对罗非鱼皮明胶热变性温度的影响

明胶的热变性是指胶原蛋白受热导致三螺旋结构的次级键断裂形成无规则的单链线团结构,从而导致胶原蛋白失去原有的性质[26]。亚氨基酸的含量影响明胶的热稳定性,亚氨基酸含量越多,其三螺旋结构就越稳定[27-28],Ikoma等[29]也曾报道,存在脯氨酸和羟脯氨酸中的吡啶环结构有助于稳定胶原的三股螺旋结构。

从图6中可以看出,不同温度条件下所提取的鱼皮明胶的热变性温度分别为(101.05±2.97)、(104.35±3.54)、(107.59±0.37)、(97.80±4.21)、(95.35±2.60)、(92.52±3.15)、(89.66±1.23) ℃,提取温度为50 ℃的鱼皮明胶的热变性温度最高,提取温度高于50 ℃时,鱼皮明胶的热变性温度逐渐降低。提取温度较低时,明胶含有较长的链，从而需要较高的温度提供较高的能量破坏明胶中的三螺旋结构[30],随着温度的升高,明胶分子降解的更为彻底,三螺旋结构越不稳定,较低的温度就可使之变性,所以热变性温度降低。提取温度为30 ℃时,可能是由于温度较低导致鱼皮中的明胶提取不充分,热变性温度略低于提取温度为50 ℃的罗非鱼鱼皮明胶。

图6 提取温度对罗非鱼鱼皮明胶的热变性温度的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on thermal denaturation temperature of gelatin from tilapia skin

2.7 提取温度对罗非鱼皮明胶流变学性能的影响

明胶中脯氨酸和羟脯氨酸的含量较高,在明胶内部交联过程中能够增加有序结构的稳定性。明胶具有一定的黏弹性,G′为储能模量或弹性模量,G″为损耗模量或黏性模量。如图7所示,随着扫描频率的增大,不同提取温度下所提取的鱼皮明胶的弹性模量、黏性模量都呈上升趋势,G′和G″的斜率逐渐减小。斜率变化小,代表明胶的内部交联越强,凝胶稳定性越好[31]。30、40 ℃提取的明胶在扫描频率较低时黏弹性斜率变化较大,凝胶稳定性较差。50、60、70 ℃条件下提取的鱼皮明胶的G′和G″的数值较为接近,80、90 ℃条件下提取的鱼皮明胶的G′和G″的数值略低70 ℃提取的明胶。G′和G″的数值越高,代表明胶内部交联越强,内部贮藏的能量越多。而随着剪切频率的升高,鱼皮明胶的弹性模量和黏性模量几乎不再变化,呈现牛顿流体的性质。提取温度高于50 ℃时斜率有所波动,可能是由于提取温度升高导致明胶分子质量变小,三螺旋结构破坏严重,明胶内部交联变少,内部贮藏的能量变小,流变性能变差。

图7 不同提取温度提取的鱼皮明胶的频率扫描流变曲线Fig.7 Frequency sweep curves of gelatin from tilapia fish skin at different extraction temperatures

3 结论

本实验分析对比了不同提取温度对罗非鱼皮明胶理化性质的影响。结果表明:罗非鱼皮明胶得率随提取温度的升高而升高,在提取温度为60～80 ℃差异不显著(p<0.05);SDS-PAGE图谱显示,当提取温度低于50 ℃时,所提取的鱼皮明胶的亚氨基组分保持较完整,由α1、α2、β3 条肽链组成,当提取温度高于60 ℃时,明胶分子降解成小分子组分,电泳条带较模糊;凝冻强度在提取温度为50 ℃时达到最大值(884.33±26.76) g;紫外吸收光谱显示,罗非鱼鱼皮明胶的芳香族氨基酸含量较少,红外光谱有微小差异,但都显示出了胶原蛋白的振动模式;热变性温度随提取温度的升高先增大后减小,在50 ℃达到最大值;提取温度通过改变明胶的分子量大小影响明胶溶液内部贮藏能量的多少,进而对明胶溶液的流变性能产生影响。以上结果表明,提取温度通过改变明胶的分子量分布继而对鱼皮明胶的凝冻强度、热变性温度、流变性能等理化性质产生影响,本研究结果可为罗非鱼鱼皮的高值化利用和鱼皮明胶的产业化生产提供参考。