大孔树脂纯化红树莓籽黄酮及其体外结合胆酸盐能力评价

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(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.大连中超食品有限公司,辽宁大连 116400; 3.辽宁新大地实业发展集团有限公司,辽宁沈阳 110168)

红树莓是蔷薇科悬钩子属植物,鲜果酸爽多汁,营养丰富,具有多种保健功效,被世界粮农组织誉为第三代“黄金水果”[1-2]。红树莓加工产生的副产物红树莓籽常被丢弃,未得到充分利用。红树莓鲜果约含10%红树莓籽,若将其所含黄酮类化合物加以利用,不仅能够变废为宝，而且可以提高红树莓附加值[3-4]。黄酮类化合物具有抗氧化、调节血脂及抑菌消炎等生理活性[5-6]。

黄酮类化合物纯化方法主要有溶剂萃取法、膜分离法及树脂法等[7],大孔树脂具有选择性好、吸附量大、吸附速度快及纯化效果好等优点,广泛用于黄酮类化合物纯化[8]。聂超等[9]采用大孔树脂纯化伦晚脐橙总黄酮,纯化后纯度达33.45%。唐巧玉等[10]利用大孔树脂纯化金橘果皮总黄酮,纯化后的总黄酮纯度达38.2%。目前,采用大孔树脂对红树莓籽黄酮类化合物纯化研究较少。

高血脂症即血液中胆固醇和脂肪的代谢或运转异常疾病,主要表现为甘油三酯、血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量高,而高密度脂蛋白胆固醇含量低[11]。高血脂能够引发动脉粥样硬化、心肌梗死及其它心血管病[12]。化学类药物能够有效治疗高血脂症,但都有一定毒副作用,因此天然降血脂活性物质的开发必将成为研究热点。胆固醇降解会产生胆汁酸盐,黄酮类化合物能够与胆酸盐结合,降低胆汁酸的重吸收率,促进肝脏或血液中的胆固醇降解,生成更多胆酸盐,从而降低血液中胆固醇含量[13]。胡凯等[14]通过构建体外模型,比较不同茶浸提液对胆酸盐的结合能力影响,结果表明茶叶中的功能性成分有降血脂功效。体外消化模型不仅重现性好,且简单易操作,因此本文通过构建体外消化模型来考察黄酮的降血脂功效。

本研究通过大孔树脂对红树莓籽黄酮进行动态吸附及解析试验,确定红树莓黄酮纯化最佳条件,为大孔树脂纯化红树莓籽黄酮应用提供理论依据;其次,以红树莓籽黄酮对胆酸盐结合率为指标,进行红树莓籽体外降血脂能力评价,为开发天然降血脂药物提供理论依据,同时也为红树莓籽开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓籽 大连中超食品有限公司;AB-8大孔树脂 天津市光复精细化工研究所;盐酸、亚硝酸钠、柠檬酸、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇 分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠 上海金穗生物科技有限公司。

ALPHA1-2 LD plus冷冻干燥机 北京奥创兴业有限公司;UV2700紫外分光光度计 日本岛津公司;RE-52旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;XZ-1真空泵 上海西利嘉真空设备制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 红树莓籽黄酮提取 按照实验室前期优化条件进行提取,取一定量60目红树莓籽粉,以料液比1∶10 g/mL加入石油醚,在40 ℃下浸泡4 h,抽滤后取粉,40 ℃干燥2 h,按1∶30 g/mL加入80%乙醇,在50 ℃下水浴提取2 h,所得提取液在55 ℃下旋转蒸发至膏状,并于冷凝温度-54 ℃，真空度20 Pa下真空冷冻干燥24 h,制得红树莓籽粗黄酮粉,备用。

1.2.2 红树莓籽黄酮浓度的测定 参照谷楠楠[15]的方法显色,芦丁标曲Y=7.75X+0.047,R2=0.9996,计算黄酮浓度。

1.2.3 AB-8大孔树脂纯化红树莓籽黄酮

1.2.3.1 大孔树脂预处理 取一定量AB-8大孔树脂在95%乙醇中浸泡24 h,充分溶胀后用去离子水冲洗至无味,再经4%盐酸浸泡12 h,蒸馏水洗至中性,再经5 mg/mL氢氧化钠浸泡12 h,蒸馏水洗至中性,45 ℃干燥备用[16]。

1.2.3.2 上样量对红树莓籽黄酮吸附效果影响 取1.2.3.1中AB-8树脂20 g湿法上柱,称取一定量1.2.1中粗黄酮粉用去离子水溶解制成10 mg/mL样液;调节pH至4.5、总上样量150 mL、以1.5 mL/min上样,流出液每10 mL收集一管,前10 mL弃去,按1.2.2中方法测定黄酮浓度,当管内黄酮含量为初始黄酮浓度1/10时视作泄漏[17]。

1.2.3.3 上样pH对红树莓籽黄酮吸附效果的影响 取1.2.3.1中AB-8树脂20 g湿法上柱,称取一定量1.2.1中粗黄酮粉去离子水溶解制成10 mg/mL样液,上样量150 mL,调节样液pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5,以1.5 mL/min上样,收集流出液,按1.2.2中方法测定黄酮浓度,计算吸附率,吸附率计算公式如下[18]:

式中:C0-上样液黄酮浓度,mg/mL;V0-上样液体积,mL;C1-流出液黄酮浓度,mg/mL;V1-流出液体积,mL。

1.2.3.4 上样流速对红树莓籽黄酮吸附效果的影响 取1.2.3.1中AB-8树脂20 g湿法上柱,称取1.2.1中粗黄酮粉,用去离子水溶解制成10 mg/mL样液,取100 mL样液,调节pH至4.5,上样流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min,收集流出液,按1.2.2中方法测定黄酮浓度,计算其吸附率。

1.2.3.5 洗脱剂用量对红树莓籽黄酮解吸效果的影响 称取1.2.1中粗黄酮粉,用去离子水溶解制成10 mg/mL样液,取100 mL样液,调节pH至4.5,以1.5 mL/min流速上样,吸附完全后,用去离子水洗至流出液无色,量取200 mL的80%乙醇以1.5 mL/min流速洗脱,流出液每10 mL收集一管,前10 mL弃去,按1.2.2中方法测定黄酮浓度,绘制洗脱曲线。

1.2.3.6 洗脱剂浓度对红树莓籽黄酮解吸效果的影响 称取1.2.1中粗黄酮粉,用去离子水溶解制成10 mg/mL样液,取100 mL样液,调节pH至4.5,以1.5 mL/min流速上样,吸附完全后,用去离子水洗至流出液无色,量取150 mL的浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇,以1.5 mL/min的流速洗脱,收集流出液,前10 mL弃去,按1.2.2中方法测定黄酮浓度,计算解吸率,解吸率计算公式如下[19]:

式中:C0-上样液黄酮浓度,mg/mL;C1-吸附后流出液黄酮浓度,mg/mL;C2-解吸后流出液黄酮浓度,mg/mL;V1-上样液体积,mL;V2-洗脱液体积,mL。

1.2.3.7 洗脱流速对红树莓籽黄酮解吸效果的影响 以最佳吸附条件上样吸附完全后,用去离子水洗至流出液无色,量取150 mL浓度为70%的乙醇,分别0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速洗脱,收集流出液,前10 mL弃去,按1.2.2中方法测定黄酮浓度,计算解吸率。

1.2.3.8 AB-8大孔树脂纯化验证试验 依据试验得到最佳条件纯化红树莓籽黄酮,将纯化后的黄酮液旋转蒸发至膏状,并置于真空冷冻干燥机中干燥24 h,取一定量用60%乙醇溶解,测定黄酮浓度,计算纯度,纯度计算公式如下[20]:

式中:C-黄酮浓度,mg/mL;V-样液体积,mL;m-黄酮干粉质量,mg。

1.2.4 红树莓籽黄酮体外结合胆酸盐能力的测定

1.2.4.1 胆酸盐标准曲线 称取一定量胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠,用磷酸缓冲溶液(pH6.3)溶解并配制成0.3 mmol/L标准溶液;分别取上述溶液0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于试管中,加磷酸缓冲溶液补齐至2.5 mL,再加入7.5 mL 60%硫酸,摇匀后于70 ℃水浴20 min,取出后冰浴5 min,在387 nm测吸光度。以胆酸盐浓度为横坐标,样液吸光度为纵坐标,绘制标准曲线[21]。

1.2.4.2 胆酸盐含量及结合率测定方法 取3组样品分别加入4 mL牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸盐溶液,37 ℃水浴恒温振荡1 h后,在8000 r/min条件下离心10 min。取2.5 mL上清液按1.2.4.1法显色,以缓冲液代替样品作为空白,测定吸光度值计算胆酸盐含量样品[22]。结合率计算公式如下:

式中:C0-为空白组中胆酸盐含量,mmol/mL;C1-样品中胆酸盐含量,mmol/mL。

1.2.4.3 不同提取及纯化方式黄酮制备 a. 醇提红树莓籽黄酮:参照本实验室前期优化条件,取一定量60目红树莓籽粉,按1∶30 g/mL加入80%乙醇,50 ℃提取2 h,所得提取液旋转蒸发至膏状,置于真空冷冻干燥机中干燥24 h,制得红树莓籽粗黄酮粉备用。

b. 纤维素酶辅助提取黄酮:参照本实验室前期优化条件,取一定量60目红树莓籽粉按1∶40 g/mL加入60%乙醇,纤维素酶加入量0.01 mg/mL,pH5.5,提取温度55 ℃下提取40 min,其余操作同醇提黄酮。

c. 超声波辅助提取红树莓籽黄酮:参照本实验室前期优化条件,取一定量60目红树莓籽粉按1∶30 g/mL加入60%乙醇,在50 ℃超声功率175 W条件下提取50 min,其余操作同醇提黄酮。

d. AB-8大孔树脂纯化红树莓籽黄酮:按上述1.2.3中最佳条件吸附并解吸,收集解吸液并将其旋转蒸发,其余操作同醇提黄酮。

1.2.4.4 不同提取方式黄酮对胆酸盐结合能力影响 称取1.2.4.3中4种树莓籽黄酮各0.25 g,参照李俶[23]等的方法进行体外胃消化2.5 h,以胃消化2.5 h作为肠消化的0 h,按闵芳芳等[24]的方法进行体外肠消化2.5 h,取经体外胃肠道消化后的样液,在8000 r/min条件下离心10 min,取上清液2.5 mL,按1.2.2.2方法测定胆酸盐含量,计算结合率。

1.3 数据处理

上述试验每组均重复3次,单因素取平均值作图,采用office办公软件作图,IBM SPAS Statistics 22.0软件进行方差分析;利用Design-Expert 8.0.1软件进行响应面数据分析。显著水平0.05。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂纯化红树莓籽黄酮工艺

2.1.1 上样量对红树莓籽黄酮吸附效果的影响 上样量是影响树脂吸附效果的重要因素,上样量少,树脂不能吸附饱和,产率低;上样量大,树脂吸附饱和后无法继续吸附,样液直接流出[25]。如图1所示,随着收集的流份增加,红树莓籽黄酮浓度逐渐增大,当收集到第10管时,黄酮浓度达到初始浓度的1/10,树脂达到了泄漏点,当超过10管后黄酮浓度迅速增大,可能是树脂吸附量已达到饱和。因此,为避免黄酮样液浪费,选取100 mL为红树莓籽黄酮最佳上样量。

图1 泄漏曲线Fig.1 The curve of adsorption leakage

2.1.2 上样pH对红树莓籽黄酮吸附率的影响 pH能够影响黄酮的电离程度,改变其存在形式和溶解度,进而影响黄酮类化合物与大孔树脂间作用力,从而影响大孔树脂对黄酮类化合物的吸附效果[26]。如图2可知,随着pH升高，红树莓籽黄酮吸附率逐渐增加,当pH达到4.5时，吸附率达到最大,而后吸附率开始缓慢降低。因此选择4.5为最佳上样pH。

图2 上样pH对红树莓籽黄酮吸附率影响Fig.2 Effect of sample pH on the adsorption of flavonoids注:图中不同字母表示梯度间存在显著性差异(p<0.05),图3、图5～图7同。

2.1.3 上样流速对红树莓籽黄酮吸附率的影响 上样流速对树脂吸附效果有明显影响,上样流速过快,样液与树脂接触时间短,吸附效果不好,上样流速过慢则吸附时间延长,效率降低,试验周期长[27]。由图3可知,随着上样流速的增加其吸附率逐渐降低,当流速超过1.5 mL/min时,吸附率显著降低(p<0.05),考虑到试验周期及生产效率,因此选择1.5 mL/min为最佳上样流速。

图3 上样流速对红树莓籽黄酮吸附率影响Fig.3 Effect of flow rate on the adsorption of flavonoids

2.1.4 洗脱剂用量对红树莓籽黄酮洗脱效果的影响 由图4可知,随着洗脱剂用量增加,洗脱出的黄酮浓度显著升高,当洗脱体积为60 mL时,黄酮浓度达到最大值。超过60 mL后再继续增加洗脱剂用量,黄酮浓度逐渐降低,当洗脱剂用量增至150 mL时,黄酮浓度几乎为0,因而选取150 mL为最佳洗脱剂用量。

图4 AB-8大孔树脂洗脱曲线Fig.4 Desorption curve of AB-8 resin

2.1.5 乙醇浓度对红树莓籽黄酮解吸率影响 不同体积分数乙醇对红树莓籽黄酮解吸率影响如图5所示。随着乙醇体积分数增加,解吸率明显上升,当体积分数为60%时,解吸率达到最高，为80.7%,乙醇浓度超过60%时,解吸率迅速降低,这可能是由于乙醇体积分数过大,解吸出的杂质也随之增加,使得解吸率降低[18]。因此确定60%乙醇为最佳洗脱浓度。

图5 乙醇浓度对红树莓籽黄酮解吸率影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

2.1.6 洗脱流速对红树莓籽黄酮解吸率影响 由图6可知,当流速在0.5～1.5 mL/min范围内,解吸率缓慢降低,洗脱流速为1.5 mL/min时,解吸率为89.3%,而后随着洗脱流速的增加,解吸率迅速降低。洗脱流速过慢,试验循环周期相应延长,流速过快，会导致洗脱剂与大孔树脂不充分,红树莓籽黄酮不能完全被洗脱下来。为提高纯化效率,选择1.5 mL/min为最佳洗脱流速。

图6 洗脱流速对红树莓籽黄酮解吸率影响Fig.6 Effect of ethanol flow rate on the desorption rate

2.1.7 红树莓籽黄酮纯化工艺验证 根据试验结果,采用最佳吸附解吸条件重复3次进行验证试验,得到树脂的平均吸附率为84.04%,解吸率为91.23%,将所得洗脱液浓缩、冻干后,得到纯化的黄酮粉末,纯度由原来的25.07%提高至48.19%,产品纯度提高了23.12%,说明该工艺条件稳定可行,可有效提升红树莓籽黄酮纯度。

2.2 红树莓籽黄酮体外结合胆酸盐效果评价

2.2.1 胆酸盐标准曲线 牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠的回归方程依次为:y=14.473x+0.0407,R2=0.9995;y=11.41x+0.0075,R2=0.9995;y=23.168x+0.036,R2=0.9993。3个标准曲线线性关系良好,可计算胆酸盐浓度。

2.2.2 不同提取方式黄酮粉结合胆酸盐效果评价 不同方式提取的红树莓籽黄酮冻干粉与牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸钠3种胆酸盐的结合能力如图7所示。3种提取法及纯化黄酮对3种胆酸盐结合能力最强的均是AB-8纯化黄酮，AB-8纯化黄酮对牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠和胆酸钠结合率依次为79.35%、74.88%和74.56%。其中，AB-8纯化黄酮和醇提黄酮对胆酸钠结合率分别为74.56%和73.06%，差异不显著(p>0.05)，结合效果较好。从整体分析,AB-8纯化黄酮对3种胆酸盐结合能力较强,其余依次为醇提、超声波和酶提黄酮。

图7 红树莓籽黄酮粉对胆酸盐吸附率的影响Fig.7 The effect of flavonoids on the adsorption rate of cholate salt

3 结论

通过AB-8大孔树脂动态吸附及解吸试验,确定纯化红树莓籽黄酮最佳条件:在pH4.5、流速1.5 mL/min条件下上样100 mL;以60%乙醇为洗脱剂,在流速1.5 mL/min下洗脱150 mL,红树莓籽黄酮纯度由25.07%升高到48.19%,提高了23.12%,说明AB-8大孔树脂适用于红树莓籽黄酮的纯化,可为后续黄酮单体分离提供参考。

AB-8纯化黄酮对牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠和胆酸钠结合率依次为79.35%、74.88%和74.56%,说明结合能力较强,其余依次为醇提、超声波和酶提黄酮,由此表明，红树莓籽黄酮对胆酸盐结合能力良好,且结合效果最好的是经AB-8纯化的黄酮,可为开发天然降血脂药物提供理论依据。