1—MCP对采后金桔青霉病的诱导抗性作用研究

刘春帅 高立阳 郑慧 金童 张晓敏 朱洁 孟亚欣 宋静 傅茂润 杨晓颖

摘要：本试验以金桔为材料，研究1-甲基环丙烯（1-MCP）对金桔采后青霉病的控制效果以及对金桔生理生化指标的影响，从而探究1-MCP对采后金桔青霉病的影响机理。研究表明：用1 mg/L的1-MCP处理金桔较对照可以显著抑制青霉病菌的生长，减小病斑直径。同时1-MCP处理能抑制金桔的呼吸强度，从而延缓果实衰老。1-MCP可以通过降低多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性、提高超氧化物歧化酶（SOD）活性、降低总酚含量提高金桔对青霉病的抗性。

关键词：1-MCP；诱导抗性；青霉病；金桔

中图分类号：S666.9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0109-06

Abstract The experiment was conducted to study the effect of 1-MCP on controlling penicilliosis and physiological and biochemical indexes of postharvest kumquat，and also exploring the mechanism of 1-MCP on penicilliosis. The results showed that 1 mg/L 1-MCP could significantly inhibit the growth of Penicillium and decrease the diameter of disease spots compared with control. At the same time， 1-MCP treatment could inhibite the respiration intensity of kumquat. The induced resistance of 1-MCP on penicilliosis was enhanced by inhibiting the activity of PPO and POD， inducing the activity of SOD， and reducing the total phenol content in kumquat.

Keywords 1-Methylcyclopropene； Induced resistance； Penicilliosis；Kumquat

金桔是一種在我国广泛种植的经济作物，年平均产量约28×104 t。金桔采摘后很容易腐烂变质，常温条件下货架期较短，每年果农因未能及时运输所致果实腐烂造成不小的经济损失。

近年来，国内对金桔的贮藏保鲜已有研究。陈浩等[1]研究表明辐照降解壳聚糖处理可显著降低金桔失重率和腐烂率，延缓总酸、可溶性固形物以及抗坏血酸含量的下降，延长贮存期达18 d，并保持其营养品质。黎继烈等[2]研究表明，臭氧可以明显抑制金桔的呼吸强度，延缓果实硬度的下降，增强SOD活性，减少丙二醛（MDA）的积累，同时提高金桔的抗病性，有效延缓果实的成熟衰老。然而这些研究仍无法满足当今市场的需求，因此研究金桔的保鲜和诱导抗性具有重要的经济意义。

1-MCP是一种新型乙烯抑制剂，具有经济、低量、无毒、绿色环保、使用方便等优点。有关1-MCP在果蔬、花卉采后保鲜及诱导抗性等方面的作用已经逐渐被学者关注。在花卉上，Serek等[3]研究发现1-MCP对延长花期、提高花卉的保鲜效果有良好的作用。在果蔬方面，1-MCP已被逐步应用于砀山酥梨[4]、草莓[5]、鲜枣[6]等水果的保鲜并具有良好的效果。1-MCP通过竞争性抑制乙烯与受体的结合，导致乙烯信号传导受阻，从而达到延缓成熟的目的[7]。金桔属非跃变型水果，1-MCP对金桔采后诱导抗性方面的研究尚未见报道。本试验目的是研究1-MCP对金桔采后青霉病的控制效果以及对金桔生理生化指标的影响，探索其在金桔采后贮藏保鲜领域的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金桔：挑选大小均匀、无病虫害、无机械伤、色泽及成熟度一致的果实为试材。采摘后当天运回实验室。

试剂：1-MCP、氢氧化钠、草酸、次氯酸钠、无水乙醇、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯二酚、愈创木酚、30%过氧化氢、甲硫氨酸、NBT、EDTA-Na2、核黄素、三氯乙酸，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

超声波清洗仪、可见光分光光度计、冷冻离心机、培养箱、高压灭菌锅（LDZF系列，上海申安医疗器械厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 金桔果实的处理 选取400枚金桔用0.5%的次氯酸钠溶液浸泡2 min（除去金桔表面病原菌），清水冲洗干净，果筐中晾干后进行以下处理：将金桔置于0.03 mm厚的聚乙烯保鲜袋内，袋中放置一袋用水浸湿的1-MCP药袋，使袋内1-MCP的最终浓度为1 mg/L，放于25℃恒温箱中贮藏，以不放1-MCP药袋为对照（CK）。每个处理设置3个平行，每个平行60枚金桔，每隔2 d观察腐烂程度并测定理化指标，共观察30 d。

1.3.2 测定指标 记录金桔果实的腐烂数量，并利用以下公式计算腐烂率：

腐烂率（%）=腐烂金桔个数/金桔总个数×100。

病斑直径：借助血细胞计数器调整指状青霉菌悬液浓度为1 × 104 cfu/mL，使用无菌铁钉刺入金桔约一个钉头深浅，用移液器吸取20 μL菌悬液进行接种。接种部位朝上置于恒温箱内培养3 d，十字交叉法测量病斑直径。

呼吸强度：采用静置法测定金桔呼吸强度。培养皿中倒入0.4 mol/L氢氧化钠溶液20 mL，平稳放置在干燥器底部。干燥器中放置24枚金桔，密封后，静置1 h。之后将培养皿中氢氧化钠溶液移入锥形瓶中。滴入两滴酚酞溶液，用0.2 mol/L草酸滴定直至溶液透明无色，静置30 s不变色，记录使用的草酸含量。

总酚含量：称取1 g果实样品，研磨成匀浆后用70%乙醇溶液洗脱，采用福林酚法[8]测定，结果以没食子酸的含量来表示。

PPO活性：称取2 g果实样品，研磨成匀浆后用5 mL 0.05 mol/L、pH 6.5磷酸缓冲液洗脱，采用邻苯二酚法测定[9]，1个活力单位（U）定义为在测定条件下1 min引起吸光值改变0.01所需的酶量。

POD活性：称取2 g果实样品，研磨成匀浆后用5 mL 0.1 mol/L、pH 6.0磷酸缓冲液洗脱，使用分光光度法测定[10]，1个活力单位（U）定义为在测定条件下1 min引起吸光值改变0.01所需的酶量。

SOD活性：称取1.5 g果实样品，研磨成匀浆后用7.5 mL 0.05 mol/L、pH 7.8磷酸缓冲液洗脱，使用分光光度法测定[11]，1个活力单位（U）定义为引起四唑氮蓝（NBT）光还原的相对抑制率为50%时所需要的酶量。

2 结果与分析

2.1 腐烂率

经过30 d的观察与记录发现，1-MCP处理组腐烂率为4.2%，对照组腐烂率为27.1%（圖1）。对照组腐烂率远高于1-MCP处理组，说明1-MCP可以有效抑制金桔果实的腐烂。

2.2 病斑直径

损伤接种指状青霉3 d后，1-MCP处理组与对照组相比，病斑面积小，发病率低。1-MCP处理组发病金桔平均病斑直径为0.2 cm，而对照组发病金桔平均病斑直径为1.1 cm（图2）。因此可以得出，1-MCP可以有效控制金桔指状青霉的病斑扩散。

2.3 呼吸强度

由图3可知，两组的呼吸强度都是先下降后上升，前4 d 1-MCP处理组呼吸强度弱于对照组，且在第2 d呼吸强度最低，接近对照组的二分之一，表明经1-MCP处理后的金桔在一段时间内呼吸强度弱于对照组，1-MCP对呼吸强度的抑制效果随时间延长而降低。

2.4 总酚

由图4可以看出，对照组金桔总酚含量在贮藏期间的变化趋势是先上升后下降，1-MCP处理则呈先降低后升高之后又降低的变化趋势。在采后贮藏的2～4 d内，1-MCP处理组与对照组总酚含量相差较大，随后两组的总酚含量逐渐接近，但1-MCP处理组的总酚含量始终低于对照组，说明1-MCP可以降低金桔中总酚含量。

2.5 多酚氧化酶

由图5A可以看出，采后金桔的PPO活性先下降后上升。1-MCP处理过的金桔PPO活性下降更快，与对照组都在第4 d达到最低值，且1-MCP处理组PPO活性比对照组更低。说明1-MCP可抑制PPO活性。

2.6 过氧化物酶

由图5B可以看出，金桔贮藏期内POD活性先上升后下降，4 d后金桔POD活性急剧降低，6 d后近乎为零，说明采后金桔POD活性维持时间不长。1-MCP处理组POD活性一直低于对照组，说明1-MCP能抑制POD活性。

2.7 超氧化物歧化酶

由图5C可以看出，1-MCP处理组与对照组的SOD活性都是先上升后下降，在第4 d达到峰值，且1-MCP处理组峰值较对照组高。试验时间内1-MCP处理组SOD活性一直高于对照组，下降速度慢于对照组。说明1-MCP可以提高SOD活性，延缓酶活下降速度。

3 讨论与结论

1-MCP对果蔬的影响主要表现在抑制植物乙烯释放量、延缓果蔬衰老和诱导果蔬提高对采后病害的抗病能力上。关于1-MCP延缓果蔬成熟衰老等方面已得到广泛研究[7]。而1-MCP对抗病功能的诱导以及植物最终的抗病表现主要因病害种类、1-MCP浓度的不同而不同[12]。骈跃斌等[13]研究表明，1-MCP对香菇的保鲜作用表现在0.9 mg/L浓度条件下能够有效抑制子实体的呼吸作用和褐变，延长保鲜时间，改善贮藏品质。Xu等[14]研究表明，1-MCP处理可以破坏炭疽病菌的孢子膜，显著抑制芒果果实炭疽病的发生。Li 等[15]研究表明，用浓度为5 μL/L的1-MCP处理可有效抑制苹果青霉病。周晓婉等[16]用1 μL/L的 1-MCP 处理苹果，较对照可显著降低苹果灰霉病的发病率，抑制病斑的扩展。Saftner等[17]研究发现，1-MCP处理可以减轻苹果受青霉、灰霉以及炭疽菌病害的影响。Jiang等[18]研究表明，“珠穆朗玛峰”草莓的主要病害是由匍枝根霉引起的果实腐烂，用1-MCP处理可以降低病害的发生。本试验表明，1-MCP能够有效控制采后金桔青霉病的生长，明显降低果实的发病率，抑制病斑直径的增大。这与上述研究及1-MCP处理防治桃[19]、枣[20]等果实采后病害的研究结果相似，说明1-MCP可以诱导部分植物抗性增强。

PPO是一类广泛分布于植物体内的由核基因编码、多基因控制的一种铜结合酶，参与生物氧化，对植物的抗病性、农产品的品质有重要的影响[21]。酚类是植物的次生代谢产物，其合成途径主要是通过苯丙烷类代谢途径，在对组织防御、果实衰老等方面有影响[22]。李保聚等[23]研究表明，黄瓜接种黑星病菌后，抗病品种叶组织中PPO活性迅速提高，明显高于对照和感病品种。石雪晖等[24]试验表明，在葡萄黑痘病暴发盛期，正常叶中的 PPO活性比病叶高，且PPO增加的比例与抗病性呈正相关。PPO还可以引起果蔬酶促褐变，果实的酶促褐变与多酚氧化酶活性密切相关。当果蔬外表皮受损时，PPO与底物的亚细胞区域化被打破，PPO底物被激活，产生黑色或褐色的沉积物，引起褐变[25]。本试验表明，1-MCP处理后，金桔的PPO活性和总酚含量与对照组相比明显下降，说明1-MCP抑制PPO的活性，对常温放置的金桔在延缓衰老等方面有影响。但试验后期，1-MCP处理组的PPO活性与对照组相比有上升的趋势，这可能与果蔬的品种有关，对于金桔PPO活性的表达还应继续探究。

过氧化物酶（POD）存在于植物、动物和微生物，是生物体中一类末端氧化酶和过氧化氢清除酶类。它与植物衰老及抗逆性都有密切关系[26，27]。POD可在生物抗病或衰老初期表达，表现为防御效应。POD也可在衰老后期表達，参与活性氧的生成，是植物体衰老到一定阶段的产物，可作为衰老指标[28]。刘红霞等[29]研究表明，1-MCP熏蒸处理桃果实后，PPO和POD的活性上升，诱导桃果实对青霉菌产生抗性，减少青霉病的发生。本试验表明，1-MCP处理后金桔的POD活性与对照组相比略有下降，说明1-MCP可影响 POD活性，但不是主要因素。这与Li等[30]认为1-MCP 能够显著促进富士苹果POD活性、延缓果实衰老、提高抗病性不同，这可能与1-MCP处理效应在不同果蔬品种上所表现的差异有关。

SOD是一种抗氧化酶。植物正常代谢过程和遭受胁迫时均能产生活性氧和自由基，活性氧和自由基的积累引起细胞结构和功能的破坏。SOD可以清除活性氧自由基，从而减少自由基对膜的损伤，达到延缓细胞衰老的目的[31]。SOD歧化超氧物阴离子自由基生成H2O2和分子氧，在保护细胞免受氧化损伤过程中具有十分重要的作用[32]。付永琦等[33]发现1-MCP能明显提高猕猴桃采后SOD活性，并推迟SOD活性峰值的出现。苏新国等[34]研究表明，1-MCP 处理菜用大豆可以保持较高的SOD和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性。在肥城桃上的研究表明，1-MCP可提高果实POD、SOD活性，延缓果实的衰老[35]。本试验表明，1-MCP处理与对照组相比，能明显提高SOD活性，可有效保护金桔免受活性氧的伤害，稳定生物膜结构，延缓金桔衰老，提高金桔抗性。

1 mg/L的1-MCP气体对金桔进行熏蒸处理，可以有效降低金桔常温放置条件下的腐烂率，控制金桔采后青霉病的发生。接种指状青霉的试验也同样证明了1-MCP可以有效抑制病斑的生长。与对照组相比，1-MCP处理减少了果实的总酚含量，抑制了PPO与POD活性，提高了SOD活性。通过改变酶的活性，进而引起金桔蛋白变化，从而延缓果实衰老，诱导抗性。因此可以推测1-MCP对于抑制金桔的成熟与腐烂、预防青霉病、诱导金桔的抗病性、延长果实的保鲜期有着良好的应用前景。

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