山东省甘薯病毒复合侵染的分子鉴定

姜珊珊 张眉 吴斌 王升吉 杜振翠 辛相启

摘要：为明确山东省甘薯病毒種类及发生现状，本研究对7个甘薯种植区进行调查及样品采集，通过RT-PCR/PCR技术分析山东省甘薯病毒种类及侵染类型。结果显示，140份甘薯样品中感染甘薯病毒的样品有133份，共检出7种甘薯病毒，其中甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus， SPCSV）检出率最高；由多种病毒复合侵染的甘薯样品占77%，单个甘薯样品中最多检出6种病毒，复合侵染组合共33种。表明山东甘薯病毒复合侵染情况严重，是威胁甘薯生产发展的重要因素。

关键词：甘薯病毒；复合侵染；分子鉴定

中图分类号：S435.313 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0097-05

Abstract In order to determine the types and occurrence status of sweet potato viruses in Shandong Province， we investigated the occurrence of virus diseases in 7 sweet potato growing areas and collected the disease samples. The virus species and infection types were identified by RT-PCR or PCR technology. The results showed that there were 133 samples were infected by viruses in the 140 samples，and 7 virus species had been detected. Among them， the detection rate of sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV） was the highest. A total of 77% sweet potato samples were infected by multiple viruses with a total of 33 types of infection combinations， and up to 6 viruses were detected in a single sweet potato sample. In conclusion， the mixed infection of sweet potato viruses was serious in Shandong Province， which was an important factor threatening the development of sweet potato production.

Keywords Sweet potato virus； Mixed infection； Molecular identification

甘薯是集粮食、饲料、工业能源原料于一体的多用途作物，在世界范围广泛种植，我国是主要的甘薯生产国之一[1]。病毒病是威胁甘薯生产的重要病害，是导致甘薯产量降低和种性退化的重要因素，可对甘薯产量造成20%～ 40%的损失，严重限制了甘薯产业的发展[2]。全世界已报道的侵染甘薯的病毒有30多种，在我国至少存在15种[3-5]。马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒是危害甘薯的主要病毒种类，包括甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus， SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G， SPVG）、甘薯潜隐病毒（Sweet potato latent virus， SPLV）、甘薯病毒2（Sweet potato virus 2， SPV2）等[6]。近年来，毛形病毒属（Crinivirus）的甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus， SPCSV）已在我国甘薯种植区广泛分布，与SPFMV协同侵染导致的甘薯病毒病害（sweet potato virus disease， SPVD）能够造成70%～100%的产量损失[6，7]。除此之外，香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）的甘薯褪绿斑病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus， SPCFV）、菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的甘薯曲叶病毒（Sweet potato leaf curl virus， SPLCV）以及黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）等皆可侵染甘薯[5]。由于甘薯主要靠扦插枝条进行种植，因此病毒可通过虫传和汁液传播，复合侵染率很高，单株可同时感染2～3种病毒。张振臣等[6]在单个甘薯样品中最多检出6种病毒。Potyvirus同属的SPFMV、SPVG、SPLV等在田间多为混合侵染[3，5]。除SPFMV之外，SPCSV还可与其他甘薯病毒进行协同侵染，加强病毒侵染及危害[8，9]。多病毒复合侵染比单病毒侵染时造成的危害更大，复制能力增强，病毒含量大幅提高，影响寄主细胞病理特征的变化，并造成症状加重[8-10]。SPFMV和SPCSV共同侵染时，SPFMV的含量比单独侵染时增加600倍[6，7]。SPCSV与Begomovirus协同侵染后会导致甘薯出现严重的叶片卷曲、黄化症状，叶片中Begomovirus病毒量同样会增加[9]。

鲁中南及鲁东地区是山东甘薯的主要产区[11]。通过连续几年对山东省甘薯病毒病害的调查发现，甘薯病毒病害日益严重，苗床发病率平均20%～30%，严重地块达50%以上[12]。初期研究显示鲁南地区甘薯病毒多复合侵染，为进一步明确山东省内甘薯病毒的发生分布、种类及侵染类型，本研究对山东省7个地区甘薯进行病样采集及病毒病害调查，提取样品总RNA和DNA，利用特异性引物进行检测，鉴定病原种类，并对甘薯病样中不同病原的侵染类型进行分析，可为今后甘薯病毒病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017—2018年甘薯苗床期，于山东潍坊、日照、临沂、威海、烟台、泰安和青岛等甘薯主栽区采集表现皱缩、畸形、矮化、褪绿等病毒病疑似样品140份，冻存于-80℃冰箱备用。

1.2 甘薯总RNA、DNA提取及cDNA合成

称取甘薯样品叶片约0.1 g，液氮冷冻后迅速研磨，按TransZol Plant多糖植物总RNA提取试剂盒说明书提取叶片总RNA，利用DNA quick Plant System DNA提取试剂盒说明书提取植物总DNA。保存于-80℃备用。按照HiScript Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis Kit说明书，以RNA为模板合成cDNA，保存于-20℃备用。

1.3 RT-PCR、PCR检测

在NCBI GenBank中下载各病毒基因组序列，利用DNAman 7.0软件分别针对SPVG、SPLV、SPLCV、SPV2、SPCFV和SPCSV设计特异性检测引物，SPFMV检测引物引用王丽等[13]已报道序列（表1）。取合成的cDNA第一链或植物总DNA为模版，利用Easy Taq DNA聚合酶进行RT-PCR/PCR扩增。扩增体系为：2 × Es Taq Master Mix 7.5 μL，F/R（10 μmol/L）引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O补足总体积至15 μL。反应条件为： 94℃ 3 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。阴性样品叶片总RNA反转录的cDNA作为阴性对照模板，ddH2O为空白对照模板。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 山东省甘薯病毒发生分布情况

2017—2018年，在山东省甘薯主栽区共采集样品140份。利用RT-PCR/PCR技术进行病原检测，结果显示阳性样品133个，采集样品带毒率达95%，共检测到7种病毒（表2），SPVG、SPLV、SPCSV和SPFMV为主要病毒，检出率皆在45%以上，其中SPCSV检出率最高，在104份样品中检测到。有少数样品被SPLCV、SPV2和SPCFV侵染，检出率在10%～18%之间。

分别对7个地区的甘薯病毒种类及检出率进行分析，结果显示，SPVG、SPLV、SPCSV和SPFMV 4种病毒在7个地区皆有分布，且在各地区的检出所占比相差不大（图1）。SPCFV仅在日照、临沂和青岛地区检出；SPLCV在潍坊、日照和临沂地区检测到；SPV2仅在泰安未检测到。

2.2 山东省甘薯病毒复合侵染类型

140份甘薯样品中，未感染病毒样品占5%，其余样品皆检测到病毒。对133份甘薯病样的病毒侵染情况进行分析，其中23%的样品为单种病毒侵染，剩余样品由多种病毒复合侵染，以2～4种病毒共同侵染为主，单个甘薯样品中最多检测到6种病毒（图2）。

对133份病样中病毒种类进行分析，复合侵染的病毒组合类型达33种。单种病毒侵染的样品中主要为SPCSV，剩余样品分别由SPLV、SPV2和SPFMV侵染（图3A）。2种病毒侵染的样品有7种组合，主要为SPFMV和SPCSV的组合（图3B）。3种病毒侵染的样品有9种组合，主要的组合为SPCSV、SPLV和SPVG（图3C）。4种病毒侵染的样品有8种组合，主要为SPFMV、SPCSV、SPLV和SPVG共同侵染（图3D）。5种病毒侵染的样品有5种组合，主要的侵染组合为SPV2、SPFMV、SPCSV、SPLV和SPVG（图3E）。6种病毒侵染的样品有4种组合，以SPV2、SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV和SPVG共同侵染为主。

3 讨论与结论

山东是甘薯种植大省，近年来由于病毒病的发生，造成甘薯巨大产量损失，而病毒种类和种群结构尚不明确。本研究通过对山东省7个地区140份甘薯样品进行检测，发现样品病毒感染率达95%，表明山东薯区病毒病已经普遍发生。所检样品中共发现SPV2、SPLCV、SPFMV、SPCSV、SPCFV、SPLV和SPVG 7种病毒，其中SPCSV、SPFMV、SPVG和SPLV在7个地区皆有分布，为山东薯区的主要病毒，这与之前的研究报道相符[5，12]。山东地区甘薯病毒主要分布在鲁中南及胶东地区（图1），SPCSV、SPFMV、SPVG和SPLV在各地区的发生所占比没有显著的地域性差异，表明这几种病毒在山东薯区已经全面分布与为害。SPV2、SPLCV和SPCFV检出量较低，发生分布具有地域差异，SPV2和SPCFV在青岛检测所占比较高，SPLCV在日照发生比重较高，表明这几种病毒还未在山东薯区全面发生，但存在大发生的威胁。

多种病毒共同侵染同一寄主是自然界中的常见现象，在甘薯病毒中也普遍存在[5，6]。山东省甘薯种植区病毒病发生情况复杂，本研究结果显示133份病样中复合侵染比例为77%，复合侵染的病毒组合达33種，单个样品中最多可检测出6种病毒，由此推测复杂的协同侵染是导致山东薯区病毒病害严重发生的主要因素。复合侵染时多种病毒会表现拮抗或协生作用。SPFMV和SPCSV复合侵染引起甘薯病毒病害（SPVD）已造成甘薯大规模减产甚至绝收，严重危害了甘薯生产，现已在世界各甘薯产区分布[6，7]。与单种病毒侵染相比，SPVD病样症状更加严重，SPFMV含量增高[6]。本研究中，133份样品中有70份样品共同检测到SPFMV和SPCSV，其中有19份样品由SPFMV与SPCSV复合侵染，占两种病毒复合侵染样品中的68%。由此表明SPVD已在山东薯区广泛分布及危害，是造成山东甘薯病毒病发生严重的重要因素之一。

综上所述，山东地区甘薯病毒种类繁多、危害广泛、复合侵染严重，已严重威胁山东甘薯产业的发展。本研究通过明确各地区甘薯病毒病的发生现状，为各地区甘薯引种及防控工作提供了技术支持与理论指导。

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