铈掺量对羟基磷灰石结构及吸附性能的影响

2018-12-07殷海荣白建光王翠翠汪枫帆

陕西科技大学学报 2018年6期

殷海荣，张森，白建光，王翠翠，王飞，陈平，汪枫帆

(陕西科技大学材料科学与工程学院，陕西西安 710021)

0 引言

随着时代的发展和医学技术的进步，越来越多的绿色生物材料被用于临床试验.羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2，Hydroxyapatite，HAp]作为脊椎动物矿物组织中的重要组成，受到越来越多研究者的青睐.据调查，HAp约占其骨骼和牙齿无机物含量的60%，具有良好的生物相容性和生物活性[1].HAp能吸附葡萄糖、蛋白质、氨基酸等，所以还被用于牙膏添加剂，有利于牙周炎的防治.HAp良好的生物活性使其能与骨质、牙齿完美的结合，植入人体后能在界面上和骨形成很强的化学性键合，能诱导和促进骨组织生长；在穿皮器械和软组织的功能恢复治疗中HAp也有一定的应用，HAp材料已广泛地应用于临床领域[2,3].

相比天然的HAp，人工合成的HAp纳米颗粒不仅具有良好的促进成骨分化的效应，还可以作为药物载体，既可以单独用于药物负载，也可以和CS、PLGA等高分子制成复合药物控释/缓释体系[4,5].人工合成的纳米HAp材料克服了传统HAp材料脆性大、难降解等的缺点，能够显著提高其生物相容性和生物活性，具有促进新生骨的生成并且不发生免疫排斥的作用.

由于HAp具有良好的离子交换性能[6,7]，故近些年来，关于离子掺杂HAp的研究越来越多，如ZnHAp、MgHAp、EuHAp、AgHAp等.合成的离子掺杂型HAp拓宽了其在生物医学、牙科和净化系统等各个领域的应用.不同离子掺杂HAp能够赋予其不同的性质.例如，A.Bootchanont等[8]研究了溶胶-凝胶法合成Sr-HA材料，发现Sr替代HAp中Ca1位置，靠近能与活骨组织结合的磷酸基团(-PO4)；Stipniece L等[9]通过喷雾干燥法合成了Mg取代的HAp生物陶瓷微球，并研究了蛋白质在MgHAp生物陶瓷微球上的吸附能力.

铈(Ce)是一种具有抗龋性能的稀土元素，Ce的生物医学性能早已被发现并应用于各种临床条件.此外，人体骨骼中的少量Ce离子可以加速生物体的新陈代谢[10,11].铈有较强抑制变形链球菌葡糖基转移酶活性的作用，也用于抗菌剂[12].铈局部应用时可置换牙齿HAp中的钙，并在牙面吸附，形成膜状沉积物，提高牙齿的抗酸蚀能力.Kanchana P等[13]以CeHA和玻璃碳电极为原料，制备了一种新型生物传感器；Yuan Q等[11]使用CeHAp与聚乳酸制备了复合涂层，研究了Ce在HAp及其复合涂层的存在形式；黄勇等[14]用微弧氧化法在纯钛金属表面原位生成了多孔含Ce羟基磷灰石生物涂层.并对膜层的厚度、物相、成分组成及生物相容性进行了研究；Priyadarshini B等[15]通过溶胶-凝胶回流技术合成了铈(Ce4+)掺杂的羟基磷灰石(CeHAp)，并进行了体外生物学研究，如血液相容性、抗菌活性和生物相容性等.

本文以化学沉淀法制备了不同掺铈比的羟基磷灰石材料，研究了铈掺量对羟基磷灰石结构和性能的影响.以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，考察了CeHAp对蛋白质的吸附性能，以期找到更好的生物载体材料.

1 实验部分

1.1 实验原料

四水硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O)](纯度≥99%)，六水硝酸铈[Ce(NO3)3·6H2O](纯度≥99%)，六水硝酸镁[Mg(NO3)2·6H2O](纯度≥99%)，磷酸氢二铵[(NH4)2HPO4](纯度≥99%)，氢氧化钠(NaOH)(纯度≥96%)，牛血清白蛋白(BSA)(纯度≥98%)和1 M磷酸盐缓冲液(PBS).实验中所用的水为超纯水，所有化学试剂均购自国药集团上海化学试剂有限公司.

1.2 CeHAp的制备

采用化学沉淀法制备不同铈掺比的羟基磷灰石材料，分别配制0.1 mol·L-1Ca(NO3)2·4H2O溶液，0.1 mol·L-1Ce(NO3)3·6H2O溶液，0.1 mol·L-1(NH4)2HPO4溶液，2 mol·L-1的NaOH溶液.将一定体积的0.1 mol·L-1的Ca(NO3)2·4H2O溶液和0.1 mol·L-1Ce(NO3)3·6H2O溶液充分混合均匀，其中控制Ce/(Ce+Ca) 的物质的量分别为0 mol%、2 mol%、4 mol%、6 mol%、8 mol%、10 mol%.向混合溶液中缓慢逐滴滴加0.1 mol·L-1(NH4)2HPO4溶液，调节溶液中的(Ce+Ca)/P的物质的量之比为1.67，使用磁力搅拌器持续搅拌混合溶液；用2 mol·L-1的NaOH溶液调节混合溶液的pH值到12，直到该混合溶液的pH值在半个小时之内不会有比较大的变动，继续搅拌4个小时.搅拌结束后再在80 ℃条件下陈化24小时，陈化结束后进行洗涤(10次以上)、抽滤、干燥，然后研磨即得到不同铈掺比的羟基磷灰石样品.其中，Ce/(Ce+Ca)=2 mol%的CeHAp记为Ce0.02HAp，其他都依此标记.反应方程式如下：

(10-X)Ca2++XCe3+/4++6PO43++2OH-→

Ca10-xCex(PO4)6(OH)2

(1)

1.3 主要表征方法

使用X射线衍射仪(XRD，D/MAX2200PC，日本)对CeHAp进行物相分析.使用傅立叶红外光谱仪(FTIR，Bruker VECTOR-22)在400～4 000 cm-1的扫描范围下分析样品的表面官能团.使用高分辨透射电子显微镜(HRTEM,JEOL-JEM2010,日本)对样品进行形貌分析.使用XPS分析样品的化学组成及元素结合状态.通过N2吸附脱附等温线来获得比表面积.孔径分布由Barrett- Joiner- Halenda(BJH)方法根据等温线的脱附曲线获得.使用紫外可见分光光度计测量吸光度.

1.4 蛋白吸附实验

1.4.1 牛血清蛋白(BSA)吸附标准曲线的绘制

分别配制浓度为0.1 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.7 mg·mL-1、0.9 mg·mL-1的BSA标准溶液，用紫外-可见分光光度计测量各标准液在280 nm处的吸光度A值，BSA的浓度为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制BSA浓度-A标准曲线，如图1所示.

图1 BSA浓度-A标准曲线

1.4.2 CeHAp样品蛋白吸附量的测定

将40 mg CeHAp加入20 mL浓度为0.5 mg·mL-1的BSA标准溶液中，充分混合后，放入37 ℃恒温摇床，振荡2 h，进行吸附实验，振荡结束的混悬液在离心机上以转速为3 000 r/min离心10 min，使用紫外-可见分光光度计测量上清液的吸光度A值，根据上述BSA浓度-A标准曲线测得上清液的浓度C上清.所有吸附实验重复三次取平均值.由下述公式计算BSA的吸附量Q:

Q=(C标准-C上清)V/W

(2)

式(2)中：Q-BSA的吸附量(mg·g-1)；C标准-BSA标准溶液的浓度，(mg·mL-1)；C上清-上清液的浓度(mg·mL-1)；V-加入的BSA的体积(mL)；W-吸附材料的质量(g).

2 结果与讨论

2.1 结构及形貌分析

图2是不同铈掺量羟基磷灰石样品的XRD图.从图2可以看出，CeHAp主要衍射峰和HAp(JCPDS 09-432)完全一致，没有β-TCP或者氧化铈等次生相的生成，说明制备的铈掺羟基磷灰石具有较高的纯度[15]；随着铈掺量的增加，主要衍射峰强度减弱，衍射峰变宽，导致这一现象的原因是Ce3+的半径(0.102 nm)大于Ca2+的半径(0.099 nm)，从而当Ce3+取代替换Ca2+后，Ce3+取代羟基磷灰石晶体结构中Ca2+的位置，致使衍射峰弱化和扩大，样品的结晶性下降[13].

图2 HAp和CeHAp样品的XRD图谱

图3显示了HAp和CeHAp样品的FTIR图谱.从图3观察到，不同铈浓度的掺杂羟基磷灰石试样的特征峰大致相同，与纯羟基磷灰石试样的特征峰一致.对于羟基磷灰石的特征峰在六个谱图中都有显示，其中，位于1 098 cm-1和1 036 cm-1处的吸收峰是属于P-O键的ν3伸缩振动吸收峰，位于962 cm-1处的吸收峰是属于P-O键的ν1伸缩振动吸收峰，而位于468 cm-1、566 cm-1以及604 cm-1处的吸收峰则是属于PO43-离子中O-P-O键的ν4伸缩振动峰[14,16]；3 569 cm-1是-OH的特征振动峰，分子水和吸附水也在1 645 cm-1处出现；在1 468 cm-1和1 419 cm-1处是碳酸根基团的振动峰.结果表明，铈掺杂对羟基磷灰石的结构无显著的影响，该结果与XRD结果一致.

图3 HAp和CeHAp样品的FTIR图谱

图4显示了HAp和CeHAp样品的TEM图像以及HRTEM结果.图4(a)中HAp的显微照片显示了具有棒状形态的颗粒.由图4可知，随着Ce含量的增加，发现颗粒尺寸逐渐减小.掺杂颗粒表现出较高的聚集趋势，这种趋势随着掺杂剂含量的增加而增加.这种影响可归因于较大的表面积与体积比，当两个颗粒相互碰撞时，如果它们之间的吸引力大于颗粒耗散的惯性力，就会形成团聚体[17].HRTEM图像可以进一步观察到排列良好的晶格条纹.HAp的晶面间距约为3.343 5 Å，属于(002)晶面.Ce0.04HAp中晶面间距为2.815 3 Å属于(211)晶面，Ce0.08HAp中晶面间距为2.730 8 Å属于(300)晶面，d002、d211和d300与文献值相符(JCPDS#09-432;d002=3.440 0 Å，d211=2.814 0 Å，d300=2.720 0 Å)，晶面间距随Ce含量的增加而略有增加.

(a)HAp样品的TEM及HRTEM图像

(b)Ce0.04HAp样品的TEM及HRTEM图像

(c)Ce0.08HAp样品的TEM及HRTEM图像图4 HAp和CeHAp的TEM及HRTEM图像

图5(a)显示了0～1 200 eV结合能范围内Ce0.06HAp样品的XPS谱，Ce0.06HAp样品的拟合Ce 3d高分辨XPS峰在图5(b)中.

从图5(a)可以看出，Ca(2p，346 eV)、P(2p，131 eV)、O(1s，530 eV)和Ce 3d区域，870～920 eV被检测到，C被用作参考.位于131 eV的P 2p核心能级峰是由于PO43-中的P-O键产生的；从图5(b)可知，结合能的值与Ce3+(3d5/2=896.47 eV，885.17 eV和3d3/2=880.87 eV，899.51 eV，904.87 eV)和Ce4+(3d5/2=882.86 eV和3d3/2=915.36 eV)一致[18,19].所有CeHAp样品显示相似的XPS光谱.这些XPS结果表明在CeHAp样品中存在Ce的混合价态(Ce3+和Ce4+)，并且证明了在HAp晶格中成功掺杂了Ce离子.

(a)Ce0.06HAp样品的XPS总图谱

(b)拟合Ce3d高分辨XPS峰图5 Ce0.06HAp样品的XPS图谱

2.2 比表面积及孔径分布分析

通过将Brunauer-Emmett-Teller(BET)方程拟合到N2吸附等温线来确定CeHAp样品的表面性质.图6显示了HAp和Ce0.06HAp的氮吸附等温线和孔径分布(插图).样品的结构参数如表1所示.

从数据可以看出，随着Ce浓度的增加，样品的比表面积逐渐增加，平均孔径逐渐减小.根据IUPAC分类，所有CeHAp样品显示类似的IV等温线和典型的H1-回滞环，表明CeHAp样品具有介孔材料的典型性质.BJH孔径分布表明中孔的存在(孔径在2 nm至20 nm之间)[20].因此，Ce离子的掺杂增加了羟基磷灰石的比表面积，并没有改变介孔羟基磷灰石的基本孔结构.在一定程度上，比表面积的增加可以改善吸附性能.

(a)HAp的N2吸附等温线和孔径分布

(b)Ce0.06HAp的N2吸附等温线和孔径分布图6 样品的N2吸附等温线和孔径分布

表1 HAp和CeHAp样品的表面性能数据

2.3 牛血清白蛋白吸附分析

图7是HAp和CeHAp样品的BSA吸附图.由图7可知，样品的吸附容量随着铈掺杂量的增加而增加.HAp和蛋白质分子之间有两种类型的吸附：通过HAp多孔结构表面弱物理吸附和HAp与BSA之间的强静电相互作用吸附[21].由于样品的尺寸逐渐变小，比表面积逐渐增加，因此在颗粒之间形成了积聚的孔隙，CeHAp的活性吸附位点更多地暴露出来，由于物理吸附，样品的吸附能力得到有效的提高.

图7 HAp和CeHAp样品的BSA吸附图

在HAp中有两种不同的吸附位点与蛋白质结合，分别为C位点和P位点.具有正电荷的C位点(主要是Ca2+)将与蛋白质中的酸性基团(主要是-COO-)结合，而带负电荷的P位点(主要是PO43-和OH-)将与碱性基团(主要是NH3+)结合.由于BSA在PBS中带负电荷，所以主要吸附在C位点[22].Ce在合成过程中替代Ca离子，有助于铈在HAp晶格中的结合.Ce离子所带电荷大于Ca离子所带电荷.因此，随着铈掺量增加，CeHAp的正表面电荷增加，样品的静电吸附也增加.