黄檗试管苗水培瓶外生根的研究

高 日， 岳园园， 徐亚男， 任镘蓉， 廉美兰， 赵 丽

(1.延边大学农学院;2.延边林业科学研究院:吉林 延吉 133000)

黄檗为芸香科(Rutaeeae)黄檗属(PhellodendronamurenseRupr.)植物，别名黄柏、黄菠萝等，主要分布于辽宁、吉林和黑龙江等地区。黄檗韧皮部主要含有小檗碱、黄檗碱和木兰碱等有效成分，具有清热燥湿和解毒疗疮等功效[1]；黄檗直立高大，木质轻，硬度大，纹理较好，是良好的木材。此外，黄檗外皮软而有弹性，9月份叶片呈黄色，是良好的观赏树木。由于黄檗具有重要的经济、药用和观赏价值，人类进行大量的采挖或剥皮，野生黄檗资源急剧减少，l987年《中国珍稀濒危保护植物名录》(第一册)将黄檗定为濒危种[2]。

组织培养技术常用于濒危植物的快速繁殖。目前，黄檗也有一些组织培养的研究报道，亓磊和詹亚光等[3]研究了培养基条件和接种量、培养时间及继代次数对黄檗愈伤组织生长的影响；张玉红等[4]以黄檗带顶芽和腋芽的茎段为材料,研究了培养条件对黄檗组培苗快繁的影响。金玲玲等[5]进行了黄柏试管苗生根研究，发现生根率达到85.1%，然而在驯化移栽过程中有大部分试管苗因不适应外界环境而死亡。瓶外生根可以大大提高移栽成活率，瓶外生根技术是将生根和驯化2个阶段结合起来，缩短了育苗周期，降低了生产成本，提高了生产效率[6]。为此，本研究进行了水培生根研究，探明了营养液中IBA浓度和EC对瓶外生根和幼苗生长的影响，同时观察了气孔的变化，为建立黄檗工厂化育苗体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

层积处理后的种子冲洗干净，在70%的酒精中浸泡30 s，用2%次氯酸钠溶液浸泡20 min，用无菌水冲洗5～6次后接种于MS培养基中。培养至种子发芽后，将幼苗切下接种于MS +BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培养基中，进行增殖培养。将增殖的试管苗切成单株(株高约2 cm)做为试验的材料。

1.2 方法

1.2.1 水培装置

在长方形容器(长×宽×高=26 cm×19 cm×7 cm)中倒入2 L营养液(表1)，并在容器底部放入孔隙为60 μm的多孔喷头，在营养液上放入划有9个“十”字刀口的泡沫板(长×宽×厚=25 cm×18 cm×0.3 cm)，泡沫板自然漂浮于营养液上。

1.2.2 IBA浓度对黄檗试管苗水培生根及生长的影响

在营养液(EC=1 mS/cm)中加入不同浓度的IBA(2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)，营养液pH值调节为6.0。营养液配方如表1。将黄檗试管苗插入容器内泡沫板的9个切口中，通入气体0.05 vvm (air volume/culture volume/min)，用塑料薄膜覆盖保湿。培养10 d后，移去塑料薄膜，30 d后调查幼苗生根及生长状况。每个处理设置3次重复，培养条件为光照强度1 600 lx，温度(25±2) ℃，每天光照16 h。

表1 营养液配方

1.2.3 营养液中EC对黄檗试管苗水培生根及生长的影响

将营养液的EC分别调节为0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mS/cm，加入IBA 3.0 mg/L，pH值调节为6.0后加入到容器中。每个容器中栽入9个试管苗，通气量调节为0.05 vvm。每个处理重复3次。培养条件和方法同1.2.2。30 d后调查幼苗生根和生长状况。

1.2.4 黄檗试管苗水培瓶外生根过程中叶片气孔变化

容器中加入含3.0 mg/L IBA的营养液(EC 1.5 mS/cm，pH值6.0)。将2 cm高的9株黄檗试管苗栽入容器中后，通入气体0.05 vvm。培养条件和方法同1.2.2，在栽苗后第2、4、6、8和10天的15:00～16:00时取苗顶部第2叶片。将透明的指甲油涂抹在叶片背面，干燥后，用镊子将指甲油层取下，放在载玻片上，在光学显微镜400倍下观察，利用Olympus显微图像分析仪(CX31，日本)调查气孔大小和气孔关闭率。每叶测3个区，每区调查4个气孔，取平均值。气孔关闭率/%=关闭气孔数/观察气孔总数×100

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 11.0软件进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法作显著性差异分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 IBA浓度对黄檗幼苗生根和生长的影响

由表2可知，将株高2 cm左右的黄檗试管苗栽植于含有不同浓度IBA的营养液中，7 d后发现茎尖小叶开始展开，10 d后茎基部开始膨大并长出根。培养30 d后调查幼苗生根及生长的结果，发现幼苗在IBA 3 mg/L时，成活率最高，达到88.7%，同时幼苗株高、地上部鲜物重和干物重也达到最大值，分别为13.4，870.0和67.3 mg(表2)；IBA浓度高于3 mg/L时，幼苗生长受到限制，株高及生物量减少。对于地下部，生根率在3和4 mg/L的IBA处理中较高，高于86%以上，根长，根鲜物重和干物重也在3和4 mg/L IBA处理中最佳。综合考虑，在营养液中加入IBA 3 mg/L较为适宜黄檗试管苗水培生根。

表2营养液中IBA浓度对黄檗幼苗生根和生长的影响

Table2EffectofIBAconcentrationinnutrientsolutiononrootingandplantletgrowthofPhellodendronemurense

IBA浓度(mg/L)成活率/%地上部株高/cm鲜物重/mg干物重/mg生根率/%地下部根长/cm鲜物重/mg干物重/mg255.4 9.6 b596.6 b53.2 b43.83.4 b7.2 b1.9 a388.713.4 a870.0 a67.3 a87.25.4 a8.3 a1.8 a465.7 9.2 b610.0 b58.2 b86.24.9 a8.2 a 1.6 ab552.37.4 c576.7 b56.2 b56.23.9 b5.3 c1.3 b

注：表中数据为0.05显著水平的多重比较结果,下同。

2.2 营养液EC对黄檗生根和幼苗生长的影响

由表3可知，营养液EC对黄檗幼苗生根有很大影响，幼苗成活率，株高，地上部鲜物重和干物重，生根率和根长随EC值的升高而增加，当EC值为1.5 mg/L时，成活率，株高，地上部鲜物重和干物重，生根率和根长分别达到92.3%，14.2 cm，943.5 mg，89.37 mg，90.3%，6.1 cm，均为最高值。当EC值继续增加时，地上部和地下部生长势，以及生根率都开始下降。适合黄檗幼苗生长EC值为1.5 mS/cm，此时成活率和生根率达到最高。

表3营养液EC对黄檗试管苗水培瓶外生根和幼苗生长的影响

Table3EffectofECinnutrientsolutiononrootingandplantletgrowthofPhellodendronemurense

EC成活率/%地上部株高/cm鲜物重/mg干物重/mg生根率/%地下部根长/cm鲜物重/mg干物重/mg0.570.29.6 d621.2 d61.2 d82.43.3 d7.1 c1.9 d1.087.511.4 c752.9 c72.5 c86.74.3 c7.7 b 2.1 bd1.592.314.2 a943.5 a89.4 a90.36.1 a8.7 a2.5 a2.087.613.4 b870.2 b80.4 b88.65.5 b8.4 a 2.3 ab2.584.211.5 c723.8 c70.1 c72.54.6 c 7.5 bc 2.0 bd

2.3 水培生根过程中气孔变化

观察黄檗水培生根过程中幼苗的叶片气孔，发现气孔长度在幼苗栽植后0～6 d无变化，到第8天时气孔长度明显增大，以后则不随培养时间的增加而增大(表4，图1)。气孔宽度在栽植后第4天起明显变小，4～10 d变化不大。气孔宽度和长度比值随着培养时间的增加呈下降的趋势，到第6天时宽度与长度比为0.7，以后则没有变化。这表明6 d以后，接近圆形的气孔逐渐拉长，趋于关闭状态。从气孔开度也可见，0 d时开度最大(11.1 μm)，8 d时明显变小，而10 d气孔开度没有变化。保卫细胞的宽度在0～4 d无变化，第6天起则变小。

表4 黄檗试管苗水培瓶外生根时叶片气孔大小的变化

注：表中数据为0.05显著水平的多重比较结果

数字代表天数；标尺为10 m

调查气孔关闭率，发现气孔在培养后的2 d内处于张开状态，从第4天开始有19%的气孔关闭，而第8天后气孔关闭率超过80%(图2)。这表明从第8天开始，气孔恢复关闭能力。试管苗的气孔处于张开状态，失去闭合功能。因此，试管苗出瓶后为避免幼苗失水过多而死亡，通常采用覆膜保湿措施，气孔恢复关闭功能后撤除保湿薄膜。黄檗试管苗在水培的第8天起叶片气孔恢复关闭能力，可进行水分代谢及光合作用，因此，栽植后第8天为黄檗试管苗水培生根培养时掀去薄膜的适宜时间。

图2 黄檗试管苗水培瓶外生根过程中叶片气孔关闭率变化

3 讨论与结论

试管苗瓶外生根技术是近几年被广泛应用的组培生根的方法，该技术主要是将试管苗生根阶段和驯化阶段结合起来，降低瓶内生根培养时所需糖以及琼脂等成本，缩短培养周期，提高移栽成活率，适合工厂化育苗[6-7]。植物在生根培养中，需要选择适合的激素种类和浓度[8]，通常选用IBA、NAA等，黄檗在瓶内培养中IBA效果优于NAA[9]。金玲玲[5]研究报道，黄檗试管苗在IBA浓度为2.0 mg/L时，瓶内生根率较高，本研究发现IBA浓度为3 mg/L时，黄檗试管苗水培瓶外生根率达到86%以上，且水培生根苗生长健壮，根系发达，这可能是因营养液中无蔗糖，幼苗进行光合作用所致，这种结果与Wang等[10]在满天星瓶外生根培养的结果相似。电导率是衡量营养液中的离子浓度高低的指标，培养液电导率的高低对植物生长发育、品质和产量有重要的影响[11-12]。在试管苗水培生根过程中，不同植物对营养液EC的要求不同。曹天旭等[13]发现EC 2.5 mS/cm适合黑莓水培瓶外生根；赵长新等[14]认为，EC 1.0 mS/cm适合栀子瓶外生根；而本试验发现黄檗试管苗瓶外生根培养时，当营养液中EC为1.5 mS/cm时，幼苗地上部和地下部生长良好。瓶内试管苗气孔长期处于张开状态，试管苗移栽前需要进行炼苗，炼苗过程气孔逐渐恢复关闭能力，具有关闭气孔能力的幼苗移栽成活率较高，试管苗瓶外生根也需要进行保湿炼苗[15]。植物气孔通常从6:00—11:00逐渐张开，11:00之后开始关闭，16:00后气孔关闭逐渐减缓。本试验在16:00观察了黄檗试管苗水培生根过程中气孔形态特征以及关闭数量，发现第8天后气孔关闭率达到82%。菜用大黄(RheumrhaponticumL.)试管苗第7天气孔关闭率达到76.5%[16]；无花果试管内生根炼苗第6天，气孔关闭率达到71%[17]，这些结果与本试验的结果基本一致。