月见草茎提取物的抗氧化活性研究

陈 琦, 张可鑫, 崔明勋, 姜 君

(延边大学农学院，吉林 延吉 132002)

月见草是属柳叶菜科月见草属植物，为1～2年生或多年生草本，生长于山区向阳坡地、林间或林原荒地等，主要分布于美洲温带地区、欧洲及亚洲，在我国主要分布于东北地区。月见草含有多种生物活性成分，如类固醇、萜类化合物、黄酮类等，具有抗炎、调节血脂、降低胆固醇的作用[1]。目前，关于月见草生物活性研究大多集中在其种子上，而对占整株70%以上的茎研究甚少。黄酮类物质可有效清除机体内自由基，延缓细胞衰老，因此，黄酮类物质的存在被认为是抗氧化反应的重要基础[2-5]。研究发现月见草茎中含有较多的黄酮类成分[6]，可以推测其具有一定的抗氧化活性。一般来说，自由基过多会使细胞发生超氧化，引起细胞结构或功能的改变[7-8]，进而引起其它疾病，如急性肺损伤，关节炎等，活性物质的抗氧化性主要是评价其对氧自由基的清除能力。

急性肺损伤是由直接或间接因素导致的肺部损伤，表现为细胞浸润及多种细胞因子的过度表达，其临床症状为呼吸困难和进行性低血氧症，目前尚无有效的治疗措施。研究发现，氧化应激是急性肺损伤的重要发病机制之一[9-10]。抗氧化剂可以降低毛细血管通透性，增强对感染的抵抗力，可治疗急性肺损伤[11]。谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)是典型的过氧化酶，髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)活性可以反应机体的氧化应激程度，活性及丙二醛(Malondialdehyde, MDA)是脂质过氧化的最终产物，因此肺组织中的GSH-Px、CAT、SOD、MPO活性和MDA含量可作为评价肺损伤程度的指标。该试验通过体内和体外试验研究月见草茎提取物的抗氧化活性，为今后月见草茎作为抗氧化相关产品的原材料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

月见草全株购于亳州大德堂药业有限公司；BALB/c 小鼠(雌性，6 周龄，22～25 g)购买于长春亿斯试验动物有限公司；GSH-Px、SOD、CAT、MDA和MPO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；ABTS、过硫酸钾购于索莱宝科技有限公司。菲啰嗪购于上海源叶生物科技有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，地塞米松(DEX)购于Singma公司。

1.2 方法

1.2.1 月见草茎提取物总黄酮含量测定

参考吴荣志等[12]的方法。称取0.1 g月见草茎，加入10 mL 70%乙醇，60 ℃水浴2 h后用蒸馏水定容至25 mL，依次加入5%亚硝酸钠和4%氢氧化钠溶液。以40 μg/mL芦丁为标准溶液，在波长510 nm处测定吸光度，根据标准液制作标准曲线，计算月见草茎的总黄酮含量。

称取1 g月见草茎，加入80 mL甲醇、5 mL盐酸和15 mL去离子水，冷凝回流1 h后旋转蒸发至1 mL，用25 mL乙酸乙酯萃取3次后，合并上层液体，使用旋转蒸发仪旋至干粉状，加入5 mL色谱甲醇溶解，膜过滤后用于HPLC分析。标准品杨梅素、槲皮素、表儿茶素没食子酸酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷及山奈酚-3-O-芸香糖的纯度均大于98。

1.2.2 月见草茎提取物对自由基清除活性的影响

称取干粉50 g月见草茎并研磨，用500 mL的70%乙醇提取3次，每次1 h，合并滤液，旋转蒸发至干粉状。

取不同浓度月见草茎提取物样品1 mL至试管中，加入1 mL 浓度为 0.1 mmol/L的 DPPH溶液，避光反应 30 min，于517 nm测量吸光度，以加入等量的超纯水作为空白对照，计算DPPH的清除活性[13]。将不同浓度的样品与0.1 mL的亚油酸反应，用紫外灯照射2 h，加入三氯乙酸4 mL和硫代巴比妥酸1 mL于95 ℃反应 90 min后，于532 nm处测量吸光度计算对烷基自由基的清除活性[14]。

参照并改进范金波等[15]的方法，对ABTS自由基清除活性进行检测。将7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾(v∶v=1∶1)混合均匀后，在室温条件下避光反应16 h。为测定清除活性，将1 mL ABTS试剂与 20 μL提取物混合，并在室温下反应6 min后在734 nm处测量吸光度，计算对ABTS的清除率。

取样品1 mL 至试管中，加入2.75 mL蒸馏水和0.05 mL 2 mmol/L FeCl2溶液，摇匀，加入0.2 mL、5 mmol/L菲咯嗪，室温静置10 min。以0.05 mL蒸馏水代替 0.05 mL FeCl2溶液为对照组，以 1 mL 蒸馏水代替 1 mL 样品稀释液为空白组，于紫外分光光度计562 nm 处测定OD 值，并计算铁离子鳌合能力。

1.2.3 月见草茎提取物对ALI小鼠体内抗氧化活性的影响

将BALB/c小鼠分为5组，每组6只：1-正常组，2-LPS组，3-低剂量组，4-高剂量组，5-阳性对照组。其中，正常组和LPS组灌胃生理盐水7 d；低和高剂量组分别用2.5和5 mg/kg月见草提取物灌胃7 d；阳性对照组用生理盐水灌胃5 d后连续2 d用7.8 mg/kg地塞米松(DEX)腹腔注射。

除正常组外，灌胃7 d后，均滴鼻LPS(5 mg/kg)，24 h牺牲小鼠。摘取小鼠右肺组织，在预冷的生理盐水中漂洗2次，以重量体积比为1∶19加入试剂盒中匀浆介质，将肺组织研磨后取上清液，即为5%组织匀浆液。根据试剂盒方法分别测定肺组织匀浆中的GSH-Px、CAT、SOD、MPO活性及MDA含量。

2 结果与分析

2.1 月见草茎中黄酮含量

植物的抗氧化性与其黄酮含量密不可分。本研究发现，月见草茎中总黄酮含量为43.29 mg/g DW，其中，杨梅素4.35 mg/g DW、槲皮素4.87 mg/g DW，表儿茶素没食子酸酯6.79 mg/g DW，槲皮素-3-O-葡萄糖苷2.45 mg/g DW，山奈酚-3-O-芸香糖5.03 mg/g DW(图1)。说明月见草茎中含有较多的黄酮类物质。

1:杨梅素;2:槲皮素;3:表儿茶素没食子酸酯;4:槲皮素-3-O-葡萄糖苷;5:山奈酚-3-O-芸香糖

2.2 月见草茎提取物体外抗氧化活性

不同浓度的月见草茎提取物对DPPH自由基的清除活性有差异，随着月见草提取物浓度的增加，清除DPPH的活性不断增强，当月见草茎提取物浓度达到32 μg/mL时，清除率达到最高并保持在最高水平，为84%(图2)。不同浓度的月见草对烷基自由基的清除活性也有差异，随着月见草提取物浓度的逐渐增加，烷基自由基的清除活性不断增强，当月见草茎提取物浓度达到32 μg/mL时，清除率达到最大，为90%(图3)。月见草茎提取物对ABTS自由基的清除活性有剂量依赖性的作用，随着月见草提取物浓度的增加，清除烷基自由基的活性不断增强，且当月见草茎提取物浓度达到1 mg/mL时，清除率达到最大，为78%(图4)。对铁离子螯合能力进行测定的结果发现，随着月见草茎提取物浓度的逐渐升高，铁离子螯合能力也逐渐增强,当提取物浓度为5 mg/mL时，铁离子螯合能力效果最佳，为34%(图5)。

图2 月见草茎提取物对DPPH自由基清除活性的影响

图4 月见草茎提取物对ABTS自由基清除活性的影响

2.3 月见草茎提取物体内抗氧化活性

用LPS刺激小鼠肺部可造成肺泡毛细血管膜损害，使氧自由基释放，因此可以通过检测氧化应激指标来评价肺损伤程度。滴鼻LPS后，每隔8 h观察小鼠状态发现，正常组小鼠精神状态良好；LPS组小鼠精神沉郁，被毛逆立。研磨小鼠肺组织获取匀浆液，使用试剂盒检测5种氧化应激相关因子活性及含量(表1)。

由表1可知，LPS组小鼠肺组织中GSH-Px、CAT、SOD活性显著降低(P<0.01)，而MPO活性和MDA含量显著升高(P<0.01)，表明急性肺损伤模型造模成功。DEX与疾病模型组相比，GSH-Px、CAT、SOD活性极显著升高(P<0.01)，MPO活性极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著降低(P<0.01)。月见草茎提取物2.5 mg/kg组MPO活性极显著降低(P<0.01)，其他4项指标无显著性差异。月见草茎提取物5 mg/kg组GSH-Px、CAT活性极显著升高(P<0.01)，CAT活性显著升高(P<0.05)，MPO活性极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著降低(P<0.01)。表明月见草茎提取物能够调节急性肺损伤小鼠肺脏中抗氧化酶活性，提高GSH-Px、及CAT、SOD活性，降低MPO活性和MDA含量。

表1 月见草茎提取物对肺组织GSH-Px，CAT，SOD，MPO活力及MDA含量的影响

注:正常组与LPS组比较，##P<0.01；月草茎低剂量组、月见草高剂量组、阳性对照组与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01.

3 讨论与结论

自由基在氧化过程中起重要作用。自由基也称“游离基”，是指化合物的分子在光热等外界条件下，共价键发生均裂而形成的具有不成对电子的原子或基团。黄酮类化合物作为一种天然的抗氧化剂，可以与铁离子络合，切断羟基自由基的生成；通过与超氧阴离子反应，制止自由基反应引发；与脂质过氧化基结合，阻断脂质过氧化过程[16]。该试验结果显示，月见草茎提取物含有较高的黄酮含量(43.29 mg/g·DW)，可以推测其具有较强的抗氧化活性。

大量研究表明，很多疾病的发生都与自由基的产生有紧密联系。机体通过酶系统或非酶系统产生自由基，对机体产生损伤。GSH-Px、CAT和 SOD 是典型的抗氧化酶，可拮抗机体氧化应激水平[17]。MPO是存在于中性粒细胞的一种酶，MPO升高，表明组织中有炎性细胞浸润，组织受到损伤[18]。大量的自由基可引发脂质过氧化作用并生成过氧化产物MDA，它的含量可显示机体受自由基攻击的程度[19]。本研究结果显示，月见草茎提取物可提高GSH-Px、CAT和SOD活性，降低MPO活性和MDA含量，说明月见草茎具有较好的抗氧化活性，其作用机制可能与减轻脂质过氧化反应和炎性细胞浸润程度以及提高抗氧化酶活性有关。因此，月见草茎提取物可提高自由基的清除活性，调控脂多糖诱导的急性肺损伤模型的小鼠氧化相关指标，具有较高的抗氧化活性，因此作为原材料可用于今后抗氧化产品的开发和应用上。