新型畜禽免疫增强剂天花粉多糖的制备工艺优化

谌馥佳，沈泽钰，管 玉，李 纳，崔霄霄，叶建春，燕照玲，李恩中*

(1.黄淮学院 生物与食品工程学院，河南 驻马店 463000； 2.信阳师范学院 化学化工学院，河南 信阳 464000； 3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002)

当前各种畜禽细菌、病毒和寄生虫等引起的感染性疾病依然是限制现代规模化养殖业发展的主要因素[1]。随着现代兽医学、免疫学及分子生物学的发展，已发现许多动物疾病都与机体免疫系统功能的失调或缺陷有密切的联系。所以在动物疾病的预防中，提高机体的免疫力和增强抵抗力得到重视。免疫增强剂可提高机体细胞的抵抗力及体液免疫能力，临床上一般和各种疫苗联合使用，可以提高机体对抗原的特异性免疫反应，增强免疫力[2]。近年来从中药中开发的天然产物越来越多地运用到兽药开发领域，其中就包括这些天然的免疫增强剂。比如壳聚糖联合新城疫疫苗对SPF雏鸡进行免疫，提高了雏鸡脾脏抗原特异性的细胞免疫应答，增强了黏膜抵抗能力[3]。人们研究发现，植物多糖是中药兽药中重要的免疫活性物质，主要具有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白细胞介素以及提高抗体水平等功能，是当今畜禽免疫增强剂研究的方向。天花粉，别名栝楼根，为葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms)的干燥根[4]。天花粉多糖的免疫调节功能已被报道[5]，若要进一步开发天花粉多糖为新型畜禽免疫增强剂，需要更加成熟的生产工艺。当前天花粉多糖提取主要运用的是传统的水浴浸提法[6]，该方法存在工艺繁杂、生产周期较长、溶剂耗量比较大、生产成本较高和提取效率比较低等缺点，因此限制了其工业化生产和大范围临床应用。近几年的研究表明，采用超声波辅助水浴法提取植物多糖，可以减少提取时间、增高提取效率、降低生产成本，并且还可有效降低多糖的降解和多糖活性的损失[7]。为此，运用超声波辅助水浴法提取天花粉多糖，在固定超声功率条件下，研究超声温度、时间和液料比对多糖得率的影响，通过Box-Behnken试验设计优化天花粉多糖超声辅助提取的工艺参数，并考察了天花粉多糖对肉仔鸡免疫器官指数的影响，为新型畜禽免疫增强剂天花粉多糖的开发利用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要药品与试剂

天花粉药材为市售，无水葡萄糖标准品(上海源叶生物科技有限公司)、无水乙醇(郑州凯圣化工有限公司)、蒽酮(上海源叶生物科技有限公司)、硫酸(焦作市鑫海隆有限公司)等试剂均为分析纯。

1.2 仪器

紫外-可见分光光度计(UV-mini1240，日本岛津公司)、电子分析天平(FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、超声清洗仪(VGT-2013QT，深圳威固科技有限公司)、酶标仪(DNM-9602G，北京普朗新技术有限公司)等。

1.3 天花粉多糖的提取和计算方法

1.3.1 天花粉多糖的提取 选取一定量的天花粉药材，烘干后粉碎，精确称取1 g天花粉药粉，采用超声辅助水浴浸提法提取2次，过滤，合并滤液，浓缩后定容，测定提取液中多糖含量。

1.3.2 多糖标准曲线的绘制 准确称取于105 ℃干燥至恒质量的无水葡萄糖标准品20.14 mg，置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并且稀释至刻度，摇晃均匀，配成质量浓度为0.201 4 mg/mL 的葡萄糖溶液。准确量取葡萄糖标准品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加水至标准刻度，摇晃均匀。准确量取上述溶液各1.0 mL，置于具塞试管中，加0.1% 蒽酮-硫酸溶液5.0 mL，摇晃均匀，水浴放置10 min，然后取出，用流水冷却，在室温下放置10 min。以相应试剂作为空白对照，用紫外-可见分光光度计在625 nm位置测定其吸光度，然后用质量浓度作为横坐标(x)，吸光度作为纵坐标(y)，绘制标准曲线[8]。

1.3.3 天花粉多糖得率测定 取10 mL天花粉提取液，利用蒽酮-硫酸法测定，按照多糖标准曲线计算出天花粉多糖的质量浓度。天花粉多糖得率的计算公式为：

其中，C为天花粉提取液多糖的质量浓度，V为天花粉提取液的体积，W为干样品的质量。

1.4 天花粉多糖提取单因素试验

1.4.1 提取温度 固定液料比为30 mL/g，提取时间为30 min，提取功率为固定功率200 W，每管中加入0.5 g天花粉药粉，分别以不同的温度(40、50、60、70、80 ℃)进行超声辅助提取，重复3次，计算多糖得率。

1.4.2 提取时间 选取最适超声温度，固定液料比为30 mL/g，提取功率为固定功率200 W，每管中加入0.5 g天花粉药粉，分别以不同时间(10、20、30、40、50 min)进行超声辅助提取，重复3次，计算多糖得率。

1.4.3 液料比 选取最适温度和时间，提取功率为固定功率200 W，每管中加入0.5 g 天花粉药粉，分别以不同的液料比(10、20、30、40、50 mL/g)进行超声辅助提取，重复3 次，计算多糖得率。

1.5 天花粉多糖提取响应面试验

依照Box-Behnken试验设计的原理，选定超声提取的温度、时间、液料比3个因素作为自变量，各单因素试验结果中的最佳条件为中心点，天花粉多糖得率作为响应值，运用Design Expert 8.0软件进行响应面试验设计，以优化多糖提取的条件参数。分别以A、B、C表示超声提取的温度、时间、液料比，编码1、0、-1代表自变量的高、中、低水平，对应多糖得率Y为响应值，响应面试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平

1.6 天花粉多糖的动物免疫试验

1.6.1 天花粉精制多糖制备 将1.3.1中所得提取滤液采用旋转蒸发仪减压浓缩至适宜浓度，加入4倍体积乙醇(体积分数80%)，低温静置24 h，制取粗多糖。采用Sevage试剂法除去粗多糖中的蛋白质。将样品放置冰箱内低温透析48 h，冷冻干燥，得天花粉精制多糖。

1.6.2 试验设计与动物饲养 选择150只1 日龄的艾维茵肉仔鸡，随机分为3 组，每组设5 个重复，每个重复10 只。对照组饲喂基础饲料，其养分含量符合美国国家委员会(NRC)标准[9]。试验组1、2饲料分别为基础饲料加0.1%天花粉多糖、基础饲料加0.3%天花粉多糖。试验鸡从1 日龄起，均采取自由采食、饮水等常规饲养管理方法。饲养试验期为42 d。

1.6.3 免疫器官指数测定 试验结束时，每组随机抽取4只鸡称空腹活体质量，颈部放血后屠宰，摘取脾脏、胸腺、法氏囊，剔除附着组织,用吸水纸拭去表面液体，准确称质量，计算胸腺、脾脏和法氏囊指数[10]。免疫器官指数(g/kg)=器官质量/活体质量。

1.7 数据处理

试验数据采用SPSS 20.0软件进行方差分析和多重比较，数据表示为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 多糖测定的标准曲线

以葡萄糖作为标准品，绘制多糖标准曲线，结果见图1，回归方程为y=0.004 3x+0.009 3，R2=0.994 6。无水葡萄糖质量浓度在0～120.84 μg/mL内与吸光度呈现良好的线性关系，该标准曲线可以用于多糖含量的测定。

图1 多糖测定标准曲线

2.2 天花粉多糖提取单因素试验结果

2.2.1 提取温度对多糖得率的影响 从图2可知，当温度在40～60 ℃时，天花粉多糖的得率随着提取温度的升高而逐渐升高，当温度为60 ℃时，多糖的得率达最大值3.21%，之后随着温度的升高，天花粉多糖的得率反而降低，这可能是由于高温破坏了天花粉多糖的组成结构，导致部分水解变成单糖等小分子物质或其他成分[11]，从而改变了天花粉多糖的得率。

图2 温度对天花粉多糖得率的影响

2.2.2 提取时间对多糖得率的影响 由图3可以看出，超声时间的长短对天花粉多糖的得率有较大的影响。随着超声时间的增加，多糖得率逐渐升高，当超声提取时间为30 min时，天花粉多糖得率最高为3.32%，之后随着时间的增加多糖得率逐渐下降。出现这种现象的原因可能是当提取的时间较短时，多糖溶解不够完全，在提取时间较长时，溶解的一部分多糖又会逐渐分解，进而导致多糖的得率略有下降[4]。所以确定天花粉多糖的最佳提取时间是30 min。

图3 时间对天花粉多糖得率的影响

2.2.3 液料比对多糖得率的影响 从图4 可以看出，随着液料比的升高，天花粉多糖的得率逐渐增高，当液料比在30 mL/g时多糖得率最高为3.28%；然后随着液料比的逐渐升高，多糖得率略有降低，这是由于随着液料比的升高，溶剂用量增加，杂质的溶解量也逐渐增加。总体考虑经济因素和后续工艺的简化，得出最佳液料比是 30 mL/g。

图4 液料比对天花粉多糖得率的影响

2.3 天花粉多糖提取响应面试验结果

选择温度、时间及液料比按表1进行Box-Behnken试验设计，多糖得率结果见表2，利用Design Expert 8.0对试验数据进行方差分析，结果如表3所示。从表3可以看出，各因素对天花粉多糖得率的影响程度从大到小依次为A>B>C，即温度>时间>液料比。模拟的回归方程为：Y=-13.067 00+0.457 45×A+0.164 85×B-4.65×103×C-2.5×105×AB+1.075×103×BC-2.25×104×AC-4.022 5×103×A2-2.572 5×103×B2-8.725×

104×C2。F模型=38.350，P模型<0.000 1，表明方程显著；P失拟项=0.543 2>0.05，表明无失拟项的存在；决定系数R2=0.980 1，表明方程能较好地反映所选参数与响应值之间的关系；变异系数CV=1.97%<5%，说明方程具有良好的重现性。此外，PredR2=0.858 9与调优R2=0.954 6较好吻合。

由表3还可以看出，提取温度(A)对天花粉多糖的得率有显著影响，提取时间(B)和液料比(C)对天花粉多糖得率的影响不显著。温度和时间(AB)、时间和液料比(BC)的相互项影响不显著，而温度和液料比(AC)的相互项影响显著，这表明温度和时间、时间和液料比的相互作用对天花粉多糖得率均无显著影响。A2和B2对天花粉多糖得率的影响极显著，C2对天花粉多糖得率的影响显著，说明对天花粉多糖得率影响的显著程度为：A2>C2，B2>C2。

表2 天花粉多糖提取响应面试验结果

表3 天花粉多糖提取二次多项式模型的方差分析

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

利用Design Expert 8.0软件分析二次多项式模型，将回归方程中的任意一个因素固定在零水平，对另外2个因素绘制3D响应面模型图(图5—7)和2D等高线模型图(图8—10)，二者可以直观地反映得率和各变量之间的相互关系。3D响应面模型图中曲面越陡峭，说明相互项对天花粉多糖的得率影响越显著，其对应等高线模型越接近椭圆。如果2D等高线模型是椭圆形，代表变量之间的相互影响显著，如果是圆形，代表变量之间的相互影响不显著[12]。因此，本试验中温度和液料比(AC)的相互项影响显著，A、B、C两两之间的相互影响显著顺序是：AC>BC>AB。

图5 温度和时间交互作用的响应面分析

图6 温度和液料比交互作用的响应面分析

图7 时间和液料比交互作用的响应面分析

对回归方程进行分析，得到超声辅助提取天花粉多糖的最佳条件是：温度60.90 ℃、时间30.39 min、液料比30.94 mL/g，多糖得率为3.30%。在温度60 ℃、时间30 min、液料比30 mL/g的提取条件下进行验证试验，天花粉多糖的得率为3.29%，与模型预测最大响应值(表2)吻合，表明模型合理有效。

图8 温度与时间交互作用的等高线模型

图9 温度与液料比交互作用的等高线模型

图10 时间与液料比交互作用的等高线模型

2.4 天花粉多糖对肉仔鸡免疫器官指数的影响

由表4可以看出，与对照组相比，试验组1、2的脾脏指数分别提高29.17%和34.72%(P<0.05)，胸腺指数分别提高5.67%(P>0.05)和15.98%(P<0.05),法氏囊指数分别提高6.49%和 10.27%(P>0.05)。结果表明，基础饲料中添加天花粉多糖能显著提高肉仔鸡的免疫器官指数，尤其是脾脏指数，从而提高肉仔鸡的免疫机能。

表4 天花粉多糖对肉仔鸡免疫器官指数的影响 g/kg

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

本研究运用单因素法和响应面法优化超声波辅助水浴提取天花粉多糖工艺。在单因素试验的基础上，将提取温度、提取时间以及水与天花粉的液料比作为自变量，天花粉多糖的得率作为响应值，做三因素三水平的响应面回归分析。通过分析各因素的显著性和交互作用，获得天花粉多糖提取的最佳工艺条件是：提取温度60 ℃、提取时间30 min、液料比30 mL/g；此时天花粉多糖的得率为3.29%，与理论预测值无显著差异。因此，采用响应面法优化的天花粉多糖提取工艺稳定可行，为天花粉多糖的生产提供了理论依据。进一步对天花粉多糖进行免疫学方面的试验，结果发现，天花粉多糖能显著提高肉仔鸡的脾脏指数,从而提高肉仔鸡的免疫机能。

天花粉多糖具有免疫增强活性，本研究通过肉仔鸡免疫试验，比较了肉仔鸡3种免疫器官指数，发现天花粉多糖能够显著提高肉仔鸡的脾脏指数，这与蒋红等[5]发现其能够有效促进小鼠脾脏免疫器官细胞增殖的结果一致。黄德尚等[13]把黄芪多糖作为佐剂联合猪瘟疫苗使用，可明显提高免疫仔猪血清γ-球蛋白、IgG、IgM和IgA的滴度。蒋伟明等[14]将马尾藻多糖和猪繁殖与呼吸综合征灭活抗原配制成疫苗用来免疫猪，结果表明，马尾藻多糖佐剂组的T淋巴细胞转化率、T淋巴细胞CD3+亚群数量高于空白组和普通佐剂疫苗组，马尾藻多糖可明显提升免疫猪血清抗体活性。王凯等[15]通过抗体效价及白细胞吞噬试验，证明杜仲多糖有增强三黄鸡禽流感和新城疫疫苗免疫应答的作用。天花粉活性多糖在畜禽免疫中的应用与开发，还需要进一步开展血清中抗体滴度和含量测定、T淋巴细胞转化率测定、病原抗体效价以及白细胞吞噬指数测定等相关验证试验。

理想的免疫增强剂不仅能提升抗原引发机体的体液及细胞免疫反应，还能促进免疫受到抑制的机体恢复[1]；具有安全无毒特性，可以用作药品、保健品或饲料添加剂不产生药物残留，以满足绿色养殖的要求[16]；由于疫苗的剂型、免疫途径及抗原种类的不断变化，也要求免疫增强剂具有较为广泛的适用性[17]。另外，质量稳定、生产成本低、可大量生产也是免疫增强剂能够推广应用的重要条件。超声波辅助水浴浸提法提取植物多糖，可以明显缩短提取时间、提高提取效率、降低生产成本，还可有效减少多糖的降解和多糖活性的损失，本研究运用单因素法和响应面法优化了超声波辅助水浴提取天花粉多糖工艺，为天花粉多糖开发为畜禽免疫增强剂提供了条件。