猫爪草中多酚的单因素提取工艺研究

王 锐，阳 莉，徐本华

(昭通学院 化学化工学院，云南 昭通 657000)

猫爪草(Ranunculi Ternati Radix)属毛茛科(Ranunculaceae)小毛茛(Ranuncuius ternatus Thunb.)的块根部分，又名三散草、全心草，大量分布在我国河南信阳地区，是国家重点发展的药材之一。据药典记载猫爪草性温，归肝、肺经，味甘、辛，具有清热解毒、化痰散结、消肿止咳、截疟等多方面疗效[1,2]。猫爪草中含有黄酮、生物碱、多酚、多糖、皂苷、挥发油及有机酸类等多种生物活性成分[3]。现代药理及临床研究表明猫爪草不仅具有抗菌、抗氧化、调节免疫等功效，而且对于淋巴结核、淋巴瘤及多种癌症有疗效[4,5]。目前，猫爪草中有效成分的提取多体现在对猫爪草中黄酮、多糖、皂苷、小毛茛内酯等成分的提取工艺研究，而对猫爪草中多酚类物质的提取工艺研究方面少见报道[6]，本实验采用乙醇提取法，通过乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为考察因素，以猫爪草中多酚浸出量为指标，对猫爪草多酚类物质提取工艺进行研究，为其在多酚类物质方面的研究提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

7200型紫外可见分光光度计(上海仪天科学仪器有限公司)；HH-S24数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科学仪器有限公司)；XFB-200家用粉碎机(吉首巿中湘制药机械厂)；AF2004精密电子分析天平(上海上平仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

猫爪草购自昆明市中药店；没食子酸标准品(上海金穗生物科技有限公司)；福林酚试剂(上海金穗生物科技有限公司)；无水乙醇，碳酸钠等均为分析纯。

2 实验方法

2.1 原料预处理

将猫爪草洗净置于电热恒温鼓风干燥箱70℃下烘干至恒重，粉碎过100目分样筛，装好备用。

2.2 多酚标准曲线的绘制

采用福林酚比色法测定多酚[7]。精密吸取质量浓度196 mg/L没食子酸标准品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于25 mL比色管中，补充去离子水至5 mL，加入1 mol/L福林酚试剂1.5 mL，摇匀，室温下放置5 min，然后加入10%碳酸钠溶液3 mL，加去离子水定容至刻度，摇匀，置于30℃水浴中恒温反应30 min，取出室温下平衡10 min，于765 nm波长处测定其吸光度。用去离子水代替样品为空白，平行测定三次，取平均值。以没食子酸质量浓度X(mg/L)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制多酚标准曲线，如图1所示。经计算机线性回归计算，得回归方程A=0.037 74X+0.018 86，线性相关系数r为0.999 3，表明没食子酸在质量浓度1.96～15.68 mg/L，浓度与其在765 nm波长处的吸光度线性关系良好，该标准曲线方程可用于猫爪草中多酚含量测定。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.3 猫爪草中多酚含量的测定

准确称取粉碎后的猫爪草1 g，按设定的料液比加入一定浓度的乙醇，在恒定温度下浸提一段时间，过滤，将滤液定容至50 mL，取待测液2 mL于25 mL比色管中，按2.2中的方法测定其吸光度，通过以下公式计算猫爪草中多酚浸出量。

式中c为标准曲线回归方程计算出的多酚质量浓度(mg/L)；v为反应体系总体积(mL)；ms为干样品质量(g)；n为稀释倍数。

2.4 猫爪草中多酚提取工艺单因素实验设计

准确称取猫爪草样品1 g，以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4个单因素设置5个水平点，平行测定每个因素每个水平点的吸光度，确定猫爪草中多酚的最佳提取工艺。单因素实验设计见表1。

表1.单因素实验设计Tabel 1.design of single factor experiment

3 结果与分析

通过乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为考察因素，以猫爪草中多酚浸出量为指标，确定猫爪草中多酚的最佳提取工艺。

3.1 乙醇浓度

设定提取温度为60℃、提取时间2 h，料液比1:30(g/mL)，以乙醇浓度分别为30%、45%、60%、75%、90%进行平行试验，按2.2中的方法测定其吸光度，并计算多酚浸出量，结果见图2。

图2 乙醇浓度对多酚提取的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenols extraction

由图2可知，随着乙醇浓度逐渐增大，猫爪草中多酚浸出量也逐渐增高，当乙醇浓度为75%时，多酚浸出量达到最大，之后随着乙醇浓度增大，多酚浸出量呈下降趋势。产生这一现象的原因可能与猫爪草中多酚的极性有关，当乙醇浓度为75%时，其极性与多酚的极性相近，利于猫爪草中多酚的有效溶出；而当继续增大乙醇浓度，猫爪草中部分脂溶性物质溶出，抑制了多酚的浸出，由此确定75%乙醇溶液提取猫爪草中多酚类物质的效果较为适宜。

3.2 料液比

固定乙醇浓度为75%，提取温度为60℃、提取时间为2 h，以料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 (g/mL)进行平行试验，按2.2中方法测定其吸光度，并计算多酚浸出量，结果见图3。

图3 料液比对多酚提取的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on polyphenols extraction

由图3所示，随着料液比的增大，猫爪草中多酚浸出量逐渐增大，当料液比为1:50 (g/mL)时，多酚浸出最多，之后再继续增大料液比，多酚浸出反而下降，这可能是因为在料液比为1:50 (g/mL)时已将猫抓草中绝大部分多酚类物质溶出，因此从节约溶剂量降低成本考虑，确定猫爪草中多酚的最佳提取料液比为1:50 (g/mL)。

3.3 提取时间

固定乙醇浓度为75%、料液比为1:50 (g/mL、提取温度为60℃，以提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5h平行进行提取，按2.2中方法测定其吸光度，并计算多酚浸出量，结果见图4。

图4 时间对多酚提取的影响Fig.4 Effect of time on polyphenols extraction

从图4可以看出，随着浸提时间的延长，猫爪草中多酚类物质的浸出量逐渐增加，在1.5 h时达到最大，1.5 h后随时间延长多酚浸出量变化不明显。这或许是由于浸提1.5 h后，猫爪草中多酚类物质的浸出量已几近饱和，溶液中多酚含量不随时间的延长而增加，并且长时间浸提，多酚类物质会因光、热、氧的作用，稳定性降低，发生降解，导致浸出量减少，所以，出于对节省工艺时间的考虑，确定最佳浸提时间为1.5 h。

3.4 提取温度

固定乙醇浓度为75%、料液比为1:50、提取时间1.5 h，分别以温度为40、50、60、70、80℃5个水平点平行进行提取，按2.2中方法测定其吸光度，并计算多酚浸出量，结果见图5。

图5 温度对多酚提取的影响Fig.5 Effect of temperature on polyphenols extraction

从图5可以看出，在40～70℃，随着浸提温度的升高，猫爪草中多酚的浸出量明显增大，70℃时达到最大，多酚浸出量为251.4μg/g；当浸取温度超过70℃后，多酚浸出量有所下降，其原因可能是在40～70℃时，随着温度的升高，分子扩散速度加快，有助细胞内多酚类物质的溶解，当温度高于70℃后，一方面由于乙醇挥发，乙醇浓度降低，多酚浸出量减少，另一方面温度高于70℃，一些热敏性的多酚类物质发生分解，含量下降，综上原因，可确定猫爪草中多酚的最佳浸提温度为70℃。

4 结论与讨论

植物多酚是植物体内含有多个酚羟基的化合物，具有抑制肿瘤、抗病毒、抗诱变、抗氧化、抗菌、消炎、镇痛等功效[8,9]。目前，猫抓草中多酚类有效成分的优化提取工艺鲜有报道[2]。本文采用单因素实验考察了乙醇浓度、料液比、时间、温度4个因素对猫爪草中多酚浸出量的影响，初步确定了最佳提取工艺为：乙醇浓度75%、料液比1:50(g/mL)、浸提时间1.5 h、浸提温度70℃，在此条件下，猫爪草中多酚的浸出量为251.4μg/g。福林酚比色法测定多酚，受显色温度，显色时间，测定波长等多种因素的影响，因此在测定时应控制实验条件在同一水平上平行操作，减少上述因素对猫爪草中多酚测定结果的影响。该实验仅为猫抓草中多酚类物质提取的初步研究，在此实验基础上，还可以探究不同溶剂、不同提取方法及不同显色方法对猫爪草中多酚测定的影响[10,11]，为猫爪草的综合开发利用提供更充分的实验依据。