甘油对红曲霉CG-6莫纳可林K合成及相关基因表达的影响

薛意斌， 任志远， 樊筱园， 杨 华， 黄朝波， 杨明冠，李贞景， 王昌禄

(天津科技大学 食品工程与生物技术学院/省部共建食品营养与安全国家重点实验室， 天津 300457)

红曲，又名丹曲，是我国重要食用、药用真菌，是传统中药红曲的基原菌，也是制作传统饮品红曲酒的主要菌种[1-2]。目前，在我国应用最为广泛的主要红曲菌种有：安卡红曲菌(M.anka)、烟色红曲菌(M.fuliginosus)、紫色红曲菌(M.prupureus)、红色红曲菌(M.ruber)和丛毛红曲菌(M.pilosus)等[3]。1979年，Endo等[4]在红曲霉发酵液中发现了一种能特异性地抑制胆固醇合成的物质，该物质与土曲霉(Aspergillusterreus)产的洛伐他汀(Lovastatin)为同一物质，是目前临床上广泛应用的降胆固醇药物之一[5-6]。莫纳可林K作为红曲霉多种功能代谢产物之一，分为内酯型和酸型两种，在一定条件下两者可以转换[7-9]。莫纳可林K作为众多莫纳可林化合物中活性较强的物质[10]，既能抑制胆固醇的合成又能保护内皮祖细胞[11]、抑制肿瘤细胞[12]等。

甘油作为常用碳源之一，对红曲菌生长和代谢有着重要作用，且不会产生碳代谢物阻遏效应[13]。然而，关于红曲霉利用甘油发酵产莫纳可林K的研究相对较少[14]。本文拟研究甘油对红曲霉CG-6发酵过程中莫纳可林K产量的影响，并采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对其合成相关基因进行分析，探讨甘油对红曲霉CG-6莫纳可林K的代谢调控机理，希望本研究能够为利用甘油等碳源提高红曲霉发酵中莫纳可林K产量提供理论参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

菌种：烟色红曲霉CG-6(MonascusCG-6)，保藏于天津科技大学食品工程与生物技术学院发酵食品与生物资源开发实验室。RNA提取试剂盒、反转录试剂盒，康为世纪生物技术公司；GoldviewI型核酸染色剂、1kb plus DNA Ladder、6×DNA Loading Buffer，北京索莱宝生物有限公司；莫纳可林K标准品(纯度99%)，美国Sigma公司；甘油、琼脂粉、蛋白胨、酵母粉、硝酸钠等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SW- CJ- 1FD型超净工作台，上海博讯事业有限公司医疗设备厂；LS- B50L型立式压力蒸汽灭菌锅，上海华线医用核子仪器有限公司；KCL2000型恒温恒湿培养箱，日本EYELA东京理化公司；AG22331型高速离心机，德国Eppendorf公司；070- 851型PCR仪，德国Biometra公司；SU1510型扫描电子显微镜，株式会社日立制作所；1200型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1红曲霉CG-6种子液制备及发酵方法

红曲霉CG-6菌种斜面加入5 mL无菌水，接种环刮下孢子，倒入100 mL种子液培养基(葡萄糖6 g，蛋白胨2 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，自来水100 mL，121 ℃灭菌20 min)中，30 ℃，180 r/min培养48 h，四层纱布过滤，调整孢子浓度至106个/mL，待用。已灭菌基础培养基(种子液培养基中添加3%琼脂)倒入平板，取200 μL种子液铺满玻璃纸表面，28 ℃培养。添加不同浓度甘油为实验组，每组3个平行。

1.3.2红曲霉CG-6莫纳可林K检测

从铺有玻璃纸平板分别取红曲霉发酵物(胞内)和培养基底物(胞外)，烘干至恒重，磨粉过100目筛。分别取0.50 g，加入4 mL 75%乙醇混匀，超声30 min，4000 r/min离心10 min，向沉淀中再加3 mL 75%乙醇混匀，超声30 min，4 000 r/min离心10 min。重复此操作，合并3次上清液，过膜进行高效液相色谱检测。根据标准曲线计算莫纳可林K产量。

色谱柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相为乙腈∶水=60∶40，水相加0.1%甲酸；分别将有机相、水相过膜，超声脱气30 min。检测器为DAD检测器，检测波长237 nm；柱温为25 ℃；流速为1 mL/min；进样量为20 μL[15]。

1.3.3甘油对红曲霉CG-6 莫纳可林K合成相关基因表达量的影响实验

从平板取面积4 cm2红曲霉菌丝体，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，酶标仪检测RNA浓度，于-80 ℃保存，备用。以RNA为模板，稀释至150 ng/μL，反转录合成cDNA，进行RT-qPCR实验，采用Actin(Gen Bank accession No.AJ417880.1)基因作为内参基因，进行莫纳可林K合成相关基因表达量测定。通过Premier 5软件设计基因mokA-mokI引物[16]。RT-qPCR反应体系如表1，反应程序如表2。每个反应做3个平行实验，重复1次。通过MxPro软件，采用相对定量分析2-△△Ct法，对莫纳可林K合成相关基因表达量进行分析[17]。

表1 SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系

表2 RT-qPCR程序

2 结果与分析

2.1 莫纳可林K标准曲线制作

图1 莫纳可林K高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of Monacolin K

检测莫纳可林K标准品和红曲霉CG-6发酵样品。酸型和内酯型莫纳可林K标准品保留时间分别为5.758、10.797 min。通过时间和光谱图(见图1)，确定样品中酸型和内酯型莫纳可林K保留时间分别为5.735、11.116 min。酸型和内酯型莫纳可林K标准曲线方程分别为y=59.947x+29.11，R2=0.999 5；y=60.49x-7.42，R2=0.999 0，两个方程具有显著相关性。

2.2 甘油浓度对红曲霉CG-6胞内莫纳可林K积累的影响

培养9 d，添加0～12%(质量分数)甘油对红曲霉CG-6胞内莫纳可林K积累量结果见图2。由图2可知，随着甘油浓度增加，胞内酸型和内酯型莫纳可林K积累量呈先增加后减少趋势；浓度为8%时，酸型和内酯型莫纳可林K积累量达到最大，分别为5 957.5、3 516.9 μg/(g干菌重)，其中酸型占总莫纳可林K的63%；当甘油浓度大于8%时，酸型和内酯型莫纳可林K积累量均开始下降，这可能是由于在该过程中过量甘油使脱水酶快速自杀性失活[18]。

图2 甘油浓度对红曲霉CG-6胞内莫纳 可林K积累量的影响Fig.2 Effect of glycerol concentrations on biomass and Monacolin K output in Monascus CG-6

2.3 甘油浓度对红曲霉CG-6胞外莫纳可林K积累的影响

培养9 d，添加0～12%甘油对红曲霉CG-6胞外莫纳可林K积累量结果见图3。由图3可知，随着甘油浓度增加，胞外酸型和内酯型莫纳可林K积累量呈先增加后减少趋势。浓度为8%时，酸型和内酯型莫纳可林K积累量达到最大，分别为4 468.1、2 537.7 μg/(g干菌重)，其中酸型占总莫纳可林K的64%；同时结合图2，胞外和胞内总莫纳可林K产量相比，胞外占胞内总莫纳可林K积累量的73.9%，这与以往研究结果胞外总莫纳可林K积累量远小于胞内不同。已有研究结果表明，甘油可通过影响脂肪酸的组成增加细胞膜通透性，进而有利于次级代谢产物外排[19-20]，因此，胞外总莫纳可林K积累量的增加可能是因为甘油作为碳源能促进红曲霉胞内总莫纳可林K的外排。

2.4 甘油为碳源时不同培养时间对莫纳可林K合成相关基因表达量的影响

甘油浓度为8%，不同培养时间对莫纳可林K合成相关基因表达量的影响见图4。由图4可知，随着培养时间延长，红曲霉CG-6莫纳可林K合成相关基因mokA、mokD、mokE、mokG、mokH、mokI表达量较对照组逐渐升高，mokB、mokC表达量变化不大，mokF表达量逐渐下降；培养前期，莫纳可林K合成基因簇整体表达量都不高，随着培养时间延长，

图3 甘油浓度对红曲霉CG-6胞外莫纳 可林K积累量的影响Fig.3 Effect of glycerol concentrations on extracellular Monacolin K output in Monascus CG-6

莫纳可林K合成相关基因表达量有所上升，且在培养9 d时，mokE、mokI表达量分别比对照组升高了240%、146%，这可能与红曲霉CG-6分解甘油所需相关脱水酶、脱氢酶的积累有关[21]。

2.5 甘油浓度对莫纳可林K基因表达量的影响

培养9 d，添加6%～8%甘油对莫纳可林K基因表达量的影响见图5。由图5可知，随着甘油浓度增加，mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH表达量呈先升高后降低趋势，mokA表达量逐渐升高，mokI表达量变化不大；甘油浓度为8%时，mokA、mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH表达量分别较对照组升高了11%、32%、23%、24%、43%、22%、16%、33%，这些基因高效表达促进莫纳可林K积累；随甘油浓度进一步增加，mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH出现下调趋势，从而引起莫纳可林K积累量下降，这与图2和图3中莫纳可林K的变化趋势相一致。

图4 甘油为碳源时不同培养时间对莫纳可林K合成相关基因表达量的影响Fig.4 Effect of glycerol on expression levels of Monacolin K synthesis related genes in different periods

图5 不同甘油浓度对莫纳可林K基因表达量的影响Fig.5 Effect of glycerol at different concentrations on expression of Monacolin K Genes

3 结 论

研究了甘油对红曲霉CG-6莫纳可林K合成及相关基因表达的影响。结果表明：甘油浓度为0～12%时，随其浓度增加，胞内和胞外总莫纳可林K积累量都呈先增加后减少趋势；甘油浓度为8%时，有利于酸型和内酯型莫纳可林K合成，其中胞外总莫纳可林K的积累量为7 005.8 μg/(g干菌重)，占胞内总莫纳可林K积累量的73.9%；随着培养时间延长，莫纳可林K合成相关基因mokA、mokD、mokE、mokG、mokH、mokI表达量较对照组逐渐升高，mokB、mokC表达量变化不大，mokF表达量逐渐下降；甘油浓度大于8%且培养9 d时，mokB、mokC、mokD、mokE、mokF、mokG、mokH出现下调趋势，基因表达量的下调引起莫纳可林K积累量下降。