玉米赤霉烯酮降解酶ZHD795编码基因克隆及降解活性研究

柴成梁， 常晓娇， 王楠希， 孙 晶， 孙长坡

(国家粮食和物质储备局科学研究院， 北京 100037)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素，具有强烈的雌性激素毒性及致癌性，严重威胁着人和动物的健康[1-3]，其主要污染的粮食作物包括玉米、大麦、小麦、高粱和黑麦等[4-6]。

ZEN的化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯。ZEN能引起人畜中毒的原因是其结构与雌性激素雌二醇(estradiol)的结构相似，能竞争结合动物细胞膜上的雌激素受体(estrogen receptor，ER)[7-10]。此生物活性主要是由ZEN的内酯键结构及4位碳原子的羟基引起[11]，因此，破坏这些结构可视为对ZEN的有效脱毒[12]。粉红粘帚霉IFO 7063被发现可催化打开ZEN的内酯键[13]，并且，负责此催化反应的内酯酶基因ZHD101被成功克隆[14]。目前，ZHD101蛋白的三维结构已经解析出，明确了ZHD101与ZEN分子的结合方式[15]，为ZHD101在消减粮食中的ZEN污染提供了重要基础。然而，应用ZHD101水解酶降解粮食中的ZEN毒素，常涉及高温、高盐、强酸等条件，在如此苛刻的工业环境下，ZHD101酶活性极低甚至消失，无法消除粮油食品中的ZEN污染。因此，需要发掘新的ZEN降解微生物以及降解酶，明确此类降解酶的催化机理，提高酶的催化活性及在工业条件下的适应性，为有效消除粮食中的ZEN污染提供基础。本研究旨在开发新的ZEN高效降解酶，并试图理解此类降解酶的催化反应机理，为消减ZEN提供理论依据。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1样品采集

筛选ZEN降解菌的样品是采集于四川省的小麦麸皮，样品采集后置于4℃冰箱中保存、备用；筛选ZEN降解菌用的毒素管为含有10 μg ZEN毒素标准品的2 mL EP管。

1.1.2试剂及培养基

用于聚合酶链式反应的引物由金唯智生物科技有限公司合成；用于分子克隆的酶购买于Invitrogen公司；ZEN标准品购买于Sigma公司；培养基及其他生化试剂购自中科天锐(北京)科技有限公司。

无机盐培养基(MSM)：MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.066 g，Na2HPO4·12H2O 6.15 g，KH2PO41.52 g，加去离子水定容至1 L，调pH值至6.8。

LB培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去离子水定容至1 L，于121 ℃灭菌20 min，固体培养基加1.5%的琼脂粉。

马铃薯葡萄糖培养基：称取200 g马铃薯切成小块，加水煮沸20～30 min，用6层纱布过滤，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000 mL，分装， 115 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

高速离心机，美国贝克曼公司；e2695型高效液相色谱仪、2475型荧光检测器、xbridge C18型色谱柱，美国Waters公司； 6510型Q-TOF LC/MS，美国Agilent公司；亲和层析柱，中科天锐(北京)科技有限公司；核酸蛋白电泳仪及凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；PCR仪，美国ABI公司；恒温摇床，上海知楚仪器有限公司；紫外可见分光光度计，赛默飞世尔公司。

1.3 实验方法

1.3.1ZEN降解菌的筛选

称取小米麸皮样品5 g，加到离心管(50 mL)中，加入30 mL无菌水振荡混匀，使样品中的微生物充分悬浮于水中，放于离心管架上静置1 h；在超净工作台中吸取上清液100 μL于ZEN毒素管中，加入400 μL MSM培养基，30 ℃，220 r/min培养15 d后，吸取100 μL菌液于新的ZEN毒素管中，再培养15 d，如此富集培养3次。吸10 μL培养的菌液，涂布MSM平板，30 ℃培养；挑取平板上长出的单菌落于ZEN毒素管中培养15 d，用高效液相色谱(HPLC)检测菌株对ZEN的降解效果。

1.3.2ZEN降解菌株的基因组测序

采用第三代纳米孔单分子测序技术(测序平台： Pacific Biosciences RS II)，对降解菌株的全基因序列信息进行测定，通过对测序数据结果的组装与注释，得到了该降解菌株的基因组编码序列信息。以ZHD101序列为模板，与测序得到的基因组编码序列进行序列比对。

1.3.3ZHD795重组表达质粒的构建

委托上海英潍捷基生物公司对ZHD795基因进行化学全合成。以合成的ZHD795基因为模板，进行PCR体外扩增。利用核酸琼脂糖凝胶电泳回收ZHD795基因，经限制性内切酶双酶切后连入PET30a载体，并转入大肠杆菌感受态细胞，筛选得到阳性重组子。

1.3.4ZHD795重组蛋白的诱导表达及纯化

扩大培养ZHD795重组子，经IPTG诱导，过夜表达ZHD795蛋白。高速离心收集菌体，加入重悬液后超声破碎，高速离心后去除菌体，上清液利用亲和层析纯化ZHD795蛋白，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZHD795蛋白的表达纯化分析。

1.3.5ZEN降解酶活性测定

取纯化后的ZHD795蛋白，加入到ZEN毒素管中，放入37 ℃培养箱中，反应3 h后，终止反应，用高效液相色谱检测，根据ZEN色谱峰的变化来判断ZHD795蛋白对ZEN是否具有降解活性；同时，以水代替ZHD795蛋白作为反应对照。经由HPLC检测，对照样品与反应样品的ZEN色谱峰面积之差，即为由ZHD795蛋白催化反应掉的ZEN分子。

1.3.6ZHD795与ZHD101对ZEN降解活性的比较

将表达纯化的ZHD795与ZHD101降解酶稀释至相同浓度，按照已构建好的酶活反应体系进行催化降解反应；经由HPLC检测，比较2个蛋白酶对ZEN的降解活性高低。

2 结果与分析

2.1 ZEN降解菌株活性分析

从四川省采集的小麦麸皮样品，在以ZEN为碳源的无机盐培养基中富集培养，经HPLC检测，得到一株ZEN降解菌，如图1。

图1 筛选得到的ZEN降解菌株Fig.1 Screening of microorganism degrading ZEN

2.2 ZEN降解菌株基因组序列分析

通过对降解菌株的全基因组测序，组装得到了38.98 Mb的序列信息，注释得到12 555个编码基因序列；将此基因组序列信息与ZHD101进行比对，得到了同源性为62%的同源蛋白ZHD795。

2.3 ZHD795蛋白酶的表达纯化分析

ZHD795基因通过PCR方法扩增后，运用核酸琼脂糖凝胶电泳进行分离回收，结果如图2。

1泳道是目的基因ZHD；M为DNA Marker。图2 ZHD795基因琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ZHD795 gene

将ZHD795基因转入大肠杆菌BL21进行ZHD795蛋白表达，运用亲和层析法纯化目的蛋白，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZHD795蛋白的表达纯化分析，结果如图3。

1泳道是表达ZHD795蛋白的菌体超声破碎后的样品；2泳道是高速离心后的上清样品；3、4泳道是从Ni-NTA亲和柱上洗脱下来的样品；M是Protein Marker。图3 ZHD795蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.3 SDS-PAGE of ZHD795 protein

2.4 ZHD795蛋白对ZEN的降解活性分析

取ZHD795蛋白液100 μL，加入到ZEN毒素管中作为反应组，以水代替ZHD795蛋白加入ZEN毒素管作为对照组，在37 ℃培养箱反应6 h后，终止反应。HPLC检测结果如图4。图4中对照组样品在保留时间为8.715 min处有强吸收峰，而反应组样品基本无ZEN目标峰检出。

在保留时间8.715 min处，无吸收峰的是反应组样品，有吸收峰的是对照组样品。图4 HPLC检测ZHD795对ZEN的降解活性Fig.4 Detection of degradation activity of ZHD795 to ZEN determined by HPLC

将ZHD795蛋白和ZHD101蛋白均稀释至质量浓度为2.0×10-3mg/mL，加入ZEN毒素管中反应30 min后终止反应。HPLC检测结果见图5。经吸收峰面积计算，在30 min内，ZHD795对ZEN的降解率为96%，而ZHD101对ZEN的降解率为37%；ZHD795对ZEN的降解酶活为ZHD101的2.5倍。

图5 ZHD795与ZHD101对ZEN降解活性比较Fig.5 Comparation of degradation activity of ZEN by ZHD795 and ZHD101

3 结 论

ZEN降解酶ZHD101能催化打开ZEN分子的内酯键，降解产物无毒性，是具有应用前景的ZEN降解酶。如何提高ZEN降解酶的催化活性及在工业条件下的适应性，是需要解决的问题。

本研究通过大量的筛选工作，在小麦麸皮样品中筛选得到一株能高效降解ZEN毒素的微生物菌株；通过第三代纳米孔单分子测序技术进行该菌株的全基因组测序，得到了该菌株的全基因组序列信息；通过与ZEN降解酶ZHD101进行序列比对，得到了一个同源性为62%的基因ZHD795，通过构建ZHD795基因原核表达体系，重组表达纯化得到ZHD795蛋白。构建ZHD795蛋白对ZEN的降解活性检测体系，检测结果表明ZHD795蛋白可降解ZEN毒素分子。通过ZHD795与ZHD101对ZEN的降解活性比较，明确了ZHD795对ZEN的降解酶活为ZHD101的2.5倍，从而得到了一个高效的ZEN降解酶。

ZHD101属于α/β水解酶家族，其活性中心包含α/β水解酶典型的催化三联体——酸- 碱- 亲核三联体，即Ser102- His242- Glu126，此催化三联体残基在一级序列中离得很远，但在三维结构中它们折叠到一起，发挥催化活性。通过一级序列比对发现，ZHD795也存在此催化三联体，下一步工作要解析ZHD795蛋白酶的三维结构，解析其催化反应机理，并与ZHD101进行结构比对，揭示造成2个降解酶对ZEN分子降解活性存在高低差异的原因，明确此类降解酶与ZEN的结合方式和催化特点，进一步通过分子改造提高此类降解酶对ZEN的催化活性及工业条件的适应性，为消减粮食及其副产物中的ZEN污染提供切实可行的技术支撑。