硫化氢荧光探针研究进展

孙宗国，洪丹奇，谢振达，朱 勍

（浙江工业大学生物工程学院，浙江 杭州 310014）

0 引言

由于荧光生物成像具有灵敏度高、选择性好、反应迅速、对细胞损伤小等优点，所以被广泛应用于生物检测技术中。在生物系统中，生理活性物质的特征包括低浓度，高反应性和短寿命。因此，精准地确定这些物种的细胞内浓度仍然是一个巨大的挑战。为了迎合这些迫切需求，基于反应型荧光探针出现了[1]。

细胞内活性硫物质（RSS）是含硫生物分子的总称，这些分子在生理和病理过程中起关键作用。谷胱甘肽（GSH）是最丰富的细胞内非蛋白质硫醇，可以控制细胞内的氧化还原活性，细胞内信号转导和基因调控。半胱氨酸（Cys）牵涉到儿童生长缓慢，肝损伤，皮肤病变，以及肌肉和脂肪的损失。同型半胱氨酸（Hcy）是一种导致阿尔茨海默病和维生素B12的不足[2]。H2S已被确定为继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种气体递质。在生理水平，H2S调节细胞内氧化还原状态和基本信号处理过程，包括监管血管紧张度，心肌收缩力，神经传递和胰岛素分泌。细胞中H2S水平异常可以诱发许多疾病，如阿尔茨海默病，肝硬化，胃粘膜损伤以及动脉和肺部高血压[3]。近年来，受益于H2S的化学反应，硫化氢荧光探针迅速增加。

1 基于硝基还原成氨基的荧光探针

含有硝基荧光团的探针设计存在一个主要障碍，主要因为硝基被认为是荧光团的强烈淬灭剂。然而，硝基在温和的条件下可以被Na2S还原生成相应的氨基基团，这就为检测H2S探针的设计合成提供了一种新方法。Wang等设计并合成了一种基于PET机制的荧光探针，此探针可以在HEPES缓冲液中用于胎牛血清中H2S的检测[4]。七甲炔花菁类荧光探针通过硝基强吸电子作用产生PET效用，使荧光发生淬灭。另一方面，硝基被还原成氨基时，氨基是长孤电子对的强供电子基团，可能存在氨基到活性荧光团的受体激发PET过程。由于取代效应的存在，探针显示出荧光发射的增加，以及量子产率从0.05增加到0.11。此探针被应用于RAW264.7细胞中的H2S的监测与跟踪。

图1 探针作用过程Figer 1 Probe process

2 基于硒亚砜还原成硒醚荧光探针

有机硒作为抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶的活性部位，可以调节细胞抗氧化防御系统，防止活性氧造成的损害，硒酶的氧化还原过程主要取决于硒化物之间的双向机制。利用催化剂的模拟循环可以帮助开发荧光探针可逆检测硫化氢[5]。由于硒亚砜和硒醚是吸电子基团和供电子基团，荧光探针可以通过PET或ICT顺利进行。Han等人设计合成了可利用有机硒基团监测H2S和ROS之间的氧化还原循环的荧光探针，此可逆荧光探针可以检测到H2S和HClO之间的氧化还原循环，该探针采用BODIPY荧光团作为信号传感器和4-甲氧基苯基硒基苯作为调节剂[6]，该探针在BODIPY荧光团和4-甲氧基苯基硒基苯的PET作用下发生荧光淬灭效应，但是氧化后的硒阻止了PET，使荧光发生Trun-on。量子产率从0.13增加到0.96。该探针可用于RAW264-7细胞中的HClO和H2S监测。

图2 探针作用过程Figer 2 Probe process

3 基于H2S亲和反应的荧光探针

H2S是可以参与活体中亲核反应的亲和试剂，H2S的亲和反应主要包括迈克尔加成反应、双键加成反应、硫解反应。

3.1 基于迈克尔加成反应的H2S荧光探针

Qian等人报道了采用BODIPY作为荧光团的H2S荧光探针[7]，该探针的H2S识别基团由α，β不饱和甲基丙烯酸盐和醛基组成，醛基可以可逆地与H2S反应形成半硫缩醛中间体，符合醛基与丙烯酸盐的迈克尔加成反应。该探针由于PET效应使荧光淬灭，在与H2S反应后荧光发生Turn-on，该探针可用于HeLa细胞中的H2S检测。

图3 探针作用过程Figer 3 Probe process

3.2 基于双键加成反应的H2S荧光探针

He等人设计了用于检测H2S的比率荧光探针[8]，该探针可以认为是香豆素和花菁通过乙烯组成的混合荧光团，该探针得益于HS-与花菁在中性条件下的快速反应，在HS-后，H2S在生理条件下，加入假吲哚C-2原子，探针的π共轭被打破，消除花菁基团的发射，保留香豆素基团发射，荧光光谱发生位移。该探针可以在30 s和80 s时间内实现溶液中和细胞中H2S的快速检测，且荧光强度增加了120倍。该探针已被应用与MCF-7细胞线粒体中H2S的检测。

图4 探针作用过程Figer 4 Probe process

3.3 基于硫解反应的H2S荧光探针

Lin等人合成了基于H2S检测的硫解反应的近红外荧光探针[9]，二硝基苯基团用于保护肽中的酪氨酸合成，硫醇在一定条件下可以去除二硝基苯基团。该探针由含有费舍尔醛的BODIPY与1-氟-2，4-二硝基苯合成，该探针由活性染料的强吸电子基团的d-PET过程，变现出无荧光。与H2S反应后，荧光团获得释放使荧光增加了18倍，检测下限达到了10-8M。该探针可用于牛血清和MCF-7细胞中的H2S检测。

图5 探针作用过程Figer 5 Probe process

4 基于硫化酮沉淀的H2S荧光探针

与Cu（II）形成的金属螯合物由于顺磁性的Cu（II）可以接受荧光团的激发态电子，从而对荧光团有淬灭作用，当除去Cu2+时，荧光复苏。这种荧光探针通常由荧光团-螯合剂-金属离子组成。根据HSAB理论，S2-对Cu（II）具有很强的亲和力，CuS沉淀相对稳定。当探针与H2S反应后，Cu（II）将从络合物中消除，荧光探针再次释放出荧光。Chang等人合成了一种检测S2-的荧光探针[10]，探针是含有二吡啶胺的荧光素的Cu2+螯合物，该探针在水溶液中检测限为420 nM。

图6 探针作用过程Figer 6 Probe process

5 叠氮化物还原成胺型荧光探针

叠氮化物和其他氧化氮物种被硫化氢还原成胺的速度比GSH和其他硫醇快，是可以检测硫化氢的。在硫化氢还原后，吸电子叠氮基团将被转化为给电子氨基，因此，开发不同供电能力的取代基，导致多功能荧光探针被开发。

图7 叠氮化物还原成胺型荧光探针总结Figer 7 Summary of strategies for fluorescent probes based on reducing azides to amines.

朱课题组研究了很多检测硫化氢的荧光探针，在2018年，其课题组利用高效碳氢活化的方法，一步制备了全新的三氮唑喹啉类新型荧光染料[11]。此探针在8-氨基喹啉的基础上，以5-三氮唑喹啉为发色团，通过引入叠氮基团，并在三氮唑基团上连接溶酶体靶向基团，成功构建了高选择性的硫化氢荧光探针。此探针由于喹啉与叠氮基团之间存在PET作用，使探针具有荧光淬灭效果，在硫化氢存在时，PET效应被打破，荧光Turn-on。

6 结论与展望

图8 探针作用过程Figer 8 Probe process

本文介绍了基于反应型H2S荧光探针的合成与作用原理。总之，探针的开发完善是一项具有挑战性的任务，探针的开发解决了关键的生物问题。未来基于反应的荧光探针设计应注意内源性小分子必须处于正常生理条件下。同时探针在避免天然物种的干扰下（如谷胱甘肽，半胱氨酸），应对低浓度底物做出荧光变化，给出可靠的结果。所有这些都要求探针具有良好的选择性，高灵敏度，良好的光稳定性，低细胞毒性，适宜的水溶性，以及在生理pH范围内反应的能力。荧光探针在临床诊断中的应用是最终目标。