阴地蕨总黄酮的提取及抗氧化活性研究
2018-12-06曹剑锋刘其高蒋小飞周进康欧岳姣徐连巧
曹剑锋， 刘其高， 蒋小飞， 周进康， 欧岳姣， 徐连巧
(1.贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳 550018； 2.贵州师范学院药用植物生物技术研究所，贵州贵阳 550018)
阴地蕨[Botrychiumternatum(Thunb) Sw.]为阴地蕨科阴地蕨属植物，别称一朵云、小春花、四块瓦等[1]，具有清热解毒、平肝熄风、止咳、止血、明目去翳等作用[2]，药用价值高。现代药理学研究表明，阴地蕨具有增强机体免疫力[3]、祛痰[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、改善肝功能以及阻断和逆转肝纤维化等功效[7]。对阴地蕨成分的研究表明，阴地蕨含有丰富的黄酮类化合物[8]。黄酮类物质因具有活性高、作用广泛等特点而被用于医药、保健食品及化妆品等领域[9-11]。因此，本试验采用超声波辅助法提取阴地蕨根中的总黄酮，并采用正交试验优化确定最佳提取工艺，对总黄酮抗氧化活性进行研究，以期为阴地蕨根黄酮的药理效用研究及天然的抗氧化剂开发利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以阴地蕨根为试验材料。试验所用试剂包括芸香苷标准品(上海源叶生物科技公司)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、水杨酸、硫酸亚铁(FeSO4)、过氧化氢(H2O2)、三羟基氨基甲烷、邻苯三酚、盐酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁(国药化学基团有限公司)等为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ5200E型超声波清洗器、FW135粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；722分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；80-2B型离心机(江苏正基仪器有限公司)；旋转蒸发仪(EYELA-N-1100，东京理化器械株式会社)。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线的绘制 采用硝酸铝络合紫外分光光度法，以芸香苷标准品为标准样绘制标准曲线。通过测定不同质量浓度芸香苷标准品在510 nm处的吸光度，得到标准曲线回归方程y=10.53x+0.008，其中，y表示测试样品液在510 nm处的吸光度，x表示样品液的浓度，标准曲线适用范围为0～100 μg/mL[12]。
1.3.2 阴地蕨根总黄酮提取及含量的测定 准确称取阴地蕨根干粉末0.08 g，并将其置于10 mL离心管中，按一定料液比(g ∶mL)添加乙醇溶液，采用一定功率超声波在一定时间内提取总黄酮。提取液在4 000 r/min的转速下离心 5 min，滤渣以同样条件提取、离心、合并上清液，然后用乙醇溶液定容至25 mL。取定容好的样品2 mL进行检测，每个水平的试验在相同条件下提取3个平行样[13-14]。
用制作标准曲线的方法测定阴地蕨根提取液中总黄酮的吸光度，根据标准曲线的回归方程计算提取液总黄酮的质量浓度，根据公式(1)计算总黄酮提取率。
(1)
表1 正交试验的因素水平
1.3.4 提取物体外抗氧化活性试验
1.3.4.1 清除·OH能力的测定 参考樊琛等的方法[15]测定提取物对·OH的清除能力。向带塞10 mL试管中依次加入 1 mL样品溶液、2 mL 1.8 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 1.8 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液和2 mL 1.96 mmol/L H2O2溶液。以蒸馏水代替样品液做空白对照，设其在510 nm处的吸光度为D0，样品溶液的吸光度为Dx，不加显色剂H2O2时的蒸馏水对照组吸光值为D1；整个反应时间为30 min，平行测定3次。根据公式(2)计算·OH清除率：
K1=[D0-(Dx-D1)]/D0×100%。
(2)
K2=(D0-D1)/D0×100%
(3)
1.3.4.3 清除DPPH·能力的测定 参照李波等的方法[17]测定提取物对DPPH·的清除能力。将DPPH用无水乙醇配制成0.2 mmol/L的溶液，分别吸取2.0 mL的样品溶液和 2.0 mL 的DPPH溶液，避光混匀，反应30 min后，于 517 nm 波长处测定吸光度值D1；另取2.0 mL不同质量浓度总黄酮乙醇溶液，加入2.0 mL无水乙醇混合均匀后测定吸光度D2；测定2.0 mL蒸馏水加入2.0 mL DPPH(1 mmol/L)溶液后的吸光度D0。根据公式(4)计算DPPH·清除率：
K3=[1-(D1-D2)/D0]×100%。
(4)
1.3.4.4 总还原力的测定 参照董兰芳等的方法[18]测定提取物的总还原力。取2.0 mL样品溶液，加入2.5 mL磷酸缓冲液(浓度为0.2 mol/L，pH值为6.6)和2.5 mL 1%铁氰化钾[K3Fe(CN)6]溶液。将此混合物在50 ℃条件下放置 20 min 后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，然后离心10 min，吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，均匀混合后在700 nm波长处测定吸光度D1。用蒸馏水做空白对照，在同样的条件下测定其吸光度D0，平行测定3次。按公式(5)计算提取物的总还原力：
K=(D1-D0)/D1×100%。
(5)
2 结果与分析
2.1 阴地蕨根总黄酮提取单因素试验结果
2.1.1 料液比对黄酮提取率的影响 由图1可知，当料液比低于1 g ∶60 mL时，随着料液比的增大，总黄酮提取率增加，当料液比为1 g ∶60 mL时，提取率达到最大值，而当料液比继续增大时提取率降低。
2.1.2 温度对黄酮提取率的影响 由图2可知，在温度低于60 ℃时，随着提取温度的升高，黄酮提取率整体呈增大趋势，当提取温度达到60 ℃时，提取率增加到最大值，而且当温度再升高时，提取率不再增加。说明升高温度有利于黄酮类物质的溶出，但温度升高到一定程度时，可能会导致一些黄酮类物质的结构被氧化破坏，从而导致总黄酮提取率降低[19]。
2.1.3 提取时间对黄酮提取率的影响 由图3可知，随着提取时间的增加，阴地蕨根的总黄酮提取率呈先增大后减小的趋势，当提取时间为50 min时，提取率增加到最大值，而随着提取时间的继续延长，提取率减小。可能的原因是一部分黄酮类物质被超声波分解，导致总黄酮提取率下降[20-21]。
2.1.4 乙醇浓度对黄酮提取率的影响 由图4可知，乙醇浓度过低，不利于阴地蕨根的总黄酮提取，低浓度乙醇条件下，黄酮的提取率较低，随着乙醇浓度的提高，提取率先增大后减小，当乙醇浓度超过80%时，提取率随着乙醇浓度的增大而降低。
2.1.5 提取次数对黄酮提取率的影响 由图5可知，随着提取次数的增多，阴地蕨根总黄酮提取率逐渐增大，当提取次数≥2次时，提取率的增长量较少。
2.2 正交试验与抗氧化活性分析
2.2.1 正交试验结果与分析 由表2可知，4种因素对提取效果的影响与“2.1”节的单因素试验结果基本相同，各因素水平之间的极差大小依次为C>A>B>D，因此影响阴地蕨根总黄酮提取率的因素主次顺序表现为乙醇浓度>料液比>提取时间>提取温度。由正交试验结果可知，最佳提取工艺为C3A3D3B1，即乙醇浓度为90%，料液比为1 g ∶70 mL，温度为 60 ℃，提取时间为40 min。
2.2.2 清除·OH正交试验结果 由表3可知，各试验组黄酮提取物对 ·OH 的清除作用差异较大，4种因素对黄酮提取物清除羟基自由基能力的影响表现为C>D>B>A，最佳试验条件为C1D1B2A3，即乙醇浓度为70%，提取温度为 40 ℃，提取时间为50 min，料液比为1 g ∶70 mL。
2.2.3 清除DPPH·正交试验结果 由表4可知，各试验组黄酮提取物对DPPH·都有一定的清除作用，且4种因素对黄酮提取物清除羟基自由基能力的影响表现为D>A>C>B，且最佳试验条件为D3A2C2B1，即提取温度为60 ℃，料液比为 1 g ∶60 mL，乙醇浓度为80%，提取时间为40 min。
表2 提取正交试验结果
表3 清除·OH正交试验结果
表4 清除DPPH·正交试验结果
表5 清除正交试验结果
2.2.5 总还原力正交试验结果 由表6可知，黄酮提取物的总还原力较强，且4种因素对黄酮提取物还原能力的影响表现为A>D>B>C，最佳试验条件为A3D3B1C3，即料液比为 1 g ∶70 mL，提取温度为60 ℃，提取时间为40 min，乙醇浓度为90%。
表6 总还原力正交试验结果
3 结论
本研究在单因素试验的基础上，进一步采用正交试验优化阴地蕨根中总黄酮提取工艺条件，结果发现，影响阴地蕨根总黄酮提取率的因素主次顺序依次为乙醇浓度>料液比>提取时间>提取温度；优化后的提取工艺条件为乙醇浓度90%，料液比1 g ∶70 mL，温度60 ℃，时间40 min。试验结果为进一步研究开发利用阴地蕨奠定了基础。
