人参皂苷Rb1对猪圆环病毒2型疫苗免疫的增强效果

2018-12-06何孔旺温立斌倪艳秀

江苏农业科学 2018年21期

汪伟，何孔旺，温立斌，肖琦，倪艳秀

(江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京 210014)

人参(ginseng)是传统补益中药，具有补气生血、扶正祛邪等功效。人参还具有多方面的药理和生物活性，含有多种类型的化学成分，人参皂苷(ginseng saponins，简称GS)是人参主要的有效成分之一[1]。迄今已从人参中分离到40余种皂苷[2]，其中以人参皂苷Rb1含量最高[3]。目前大量研究表明，GS在免疫答应中具有较好的佐剂作用[4]，能够显著提高体液免疫应答和细胞免疫答应[5]。猪圆环病毒(porcine circovirus，简称PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员，为无囊膜、单链负股DNA病毒，于1982年由Tischer等首次发现[6]，是目前发现最小的病毒之一，有2个血清型；其中，猪圆环病毒2型(PCV2)对猪群具有致病性，是猪圆环病(porcine circovirus diseases，简称PCVD)的主要病原[7]。PCV2影响猪机体的免疫系统功能的发挥，从而产生免疫抑制[8]，给全世界养猪业造成了重大的经济损失[9]。该病目前仍无有效治疗措施，疫苗接种是预防PCV2感染的主要途径[10-12]。本研究旨在探索将人参皂苷Rb1单体作为免疫增强剂与PCV2疫苗混合后使用，研究人参皂苷Rb1对PCV2疫苗的免疫增强效果，为PCV2疫苗更好地发挥作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

20只清洁级Babc/c雌性小鼠购自扬州大学比较医学中心。本试验于2016年4—6月在江苏省农业科学院动物试验中心进行。

1.2 试剂与仪器

2%氢氧化铝佐剂，由北京希凯创新科技有限公司提供；人参皂苷Rb1单体标准品、纯度98.0%以上，由南京泽朗医药科技有限公司提供；用生理盐水配制成浓度为10 mg/mL，0.22 μm 滤器过滤除菌；病毒DNA提取试剂盒，由北京天恩泽科技有限公司；ABI 7500荧光定量PCR仪，由美国ABI公司提供。

1.3 PCV2疫苗抗原及攻毒用PCV2强毒

PCV2疫苗抗原由笔者所在实验室用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得，抗原浓度为10 μg/mL。攻毒用PCV2强毒，为笔者所在实验室自行分离鉴定并由PK-15细胞传代获得，IFA测得其TCID50为10-6/mL。

1.4 疫苗制备与动物免疫

以总体积1 400 μL无菌配制疫苗，混匀后4 ℃放置 72 h。将小鼠随机分为4组(表1)，疫苗免疫前再次混匀，每只小鼠腹腔免疫疫苗200 μL。

1.5 PCV2血清抗体检测

表1 试验分组与疫苗配制

1.5.2 比较3种配方疫苗免疫后21 d抗体效价将各组 21 d 小鼠血清作50、100、200、400、800、1 600倍稀释，用实验室已经建立的PCV2抗体间接ELISA检测方法检测血清抗体效价。具体检测方法同“1.5.1”节。

1.6 PCV2强毒攻毒

免疫后21 d，对小鼠进行腹腔攻毒，每只小鼠注射 300 μL 病毒液；攻毒后28 d，眼球采血并处死所有小鼠。

1.7 血清病毒载量检测

用病毒DNA提取试剂盒提取小鼠血清病毒DNA，用笔者所在实验室已经建立的PCV2荧光定量PCR方法检测血清中的病毒载量。荧光定量PCR经优化，25 μL反应体系如下：2×Premix ExTaq(Probe qPCR)12.5 μL，上、下游引物(10 μmmol/L)各0.5 μL，探针(10 μmol/L)0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5 μL，质粒模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。引物与探针序列如表2所示。

表2 PCV2荧光定量PCR检测方法的引物与探针

1.8 统计分析

所有试验数据在SPSS 22.0软件下采用独立样本t检验进行统计分析，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 免疫后的抗体滴度和抗体效价

2.1.1 抗体滴度随免疫时间的变化 3种配方的疫苗免疫小鼠后，均可刺激小鼠产生PCV2特异性抗体。其中C、D组在免疫后14 d，血清即转阳；在14 d时，C、D组血清D450 nm明显高于A、B组。而B组血清仍为阴性，其在21 d血清才转阳(图1)。另在免疫后14、21 d，D组血清D450 nm均要略高于C组，但差异不显著。添加人参皂苷Rb1的2组疫苗，其产生特异性抗体时间要早于不添加组疫苗。

2.1.2 3种配方疫苗免疫后21 d抗体效价差异 D组疫苗产生的抗体滴度明显高于B、C组；同时，C组整体抗体效价也高于B组，但无显著差异。添加人参皂苷Rb1的疫苗抗体效价要高于不添加的疫苗，且高剂量组抗体滴度高于低剂量组(图2)。

2.2 攻毒后血清病毒载量

攻毒后28 d，检测小鼠血清病毒载量，未免疫组(A组)血清病毒载量明显高于疫苗免疫组(P<0.01)(图3)。高剂量组血清病毒阳性率也明显低于其他组，结果表明，高剂量人参皂苷Rb1具有较高的抑制病毒增殖的功效(表3)。

3 结论与讨论

将人参皂苷Rb1单体与PCV2疫苗混合免疫小鼠后，能够明显缩短抗体产生时间，显著提高抗体效价，降低血清病毒载量及血清病毒阳性率，具有较好的免疫增强效果，是一种较好的免疫增强剂。

人参皂苷能够显著提高机体的体液免疫应答和细胞免疫应答，其机制可能是激活机体的先天性免疫[13]。目前有研究将人参皂苷Rb1作为佐剂或免疫增强剂与不同病原疫苗混合后免疫动物，均可以产生免疫增强作用。Rivera等将人参皂苷Rb1与猪细小病毒(porcine parvovirus，简称PPV)疫苗混合后免疫，能够显著提高疫苗抗体应答，并诱导多种细胞因子，结果表明激活了Th1、Th2答应[14-15]。史秀山将人参皂苷Rb1作为人用纯化非洲绿猴肾细胞(vero细胞)狂犬病疫苗的佐剂免疫小鼠，结果表明，单针免疫加入人参皂苷Rb1后抗体效价高且抗体产生时间早，且加入人参皂苷Rb1后抗体水平达到5针常规免疫抗体水平[16]。Zhang等将人参皂苷制备成纳米粒子佐剂与鸡艾美儿球虫重组抗原形成重组亚单位疫苗，能够促使疫苗产生强烈的免疫应答和免疫保护[17]。胡松华等将人参皂苷Rb1以及氢氧化铝胶作为佐剂和金黄色葡萄球菌菌体抗原混合免疫豚鼠，并用Rb1和奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌菌苗混合免疫奶牛[18]；结果表明，Rb1组豚鼠血清抗体滴度比对照组和氢氧化铝胶佐剂组增加快，幅度显著增高，Rb1组奶牛血清抗体滴度比对照组奶牛显著增加。以上研究均表明，人参皂苷及其单体具有良好的免疫增强作用，可作为新的佐剂成分用于疫苗生产。