茶树品种及生长期对茶叶有机酸含量的影响

刘盼盼， 郑鹏程， 郭桂义， 金孝芳， 尹 鹏， 高士伟， 王胜鹏， 叶 飞， 郑 琳， 龚自明

(1.湖北省农业科学院果树茶叶研究所/湖北省茶叶工程技术研究中心，湖北武汉 430064； 2.信阳农林学院/河南省豫南茶树资源综合开发重点实验室，河南信阳 464000)

茶叶中主要有奎尼酸、草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸、没食子酸等近30种有机酸[1]。茶叶中的脂肪族有机酸对滋味的贡献较大，而芳香族有机酸等是香气的主要成分，它们在茶叶冲泡过程中大多数可被浸出到茶汤中，成为影响茶汤风味品质的主要成分之一[2]。众多研究证实，有机酸有很强的抗氧化能力，对茶多酚、维生素等组分的抗氧化活性有明显的增效作用[3-5]。有机酸作为食品添加剂也被广泛用于果、蔬汁饮料中，其中柠檬酸、苹果酸和酒石酸主要作为酸味剂，而抗坏血酸常作为抗氧化剂[6]。

目前，茶叶中有机酸的分析方法主要有酸碱滴定法、气相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等[7-10]。其中酸碱滴定法影响因素较多，准确度较差；气相色谱法需要在分离前对有机酸进行衍生，样品前处理繁琐费时且回收率低；离子色谱法由于对样品中蛋白质含量有严格的限定，不适合作复杂的样品分析，且对低分子量有机酸检测的准确度不高；毛细管电泳法相对于其他分析方法来说，重现性存在明显不足；高效液相色谱法具有灵敏度高、分离效果好的优点，是目前有机酸分析中最成熟、也最常用的方法[11-12]。刘盼盼等研究了不同叶位、不同品种和不同茶类茶叶中有机酸的含量，以及不同冲泡条件下有机酸的浸出特性，结果表明奎尼酸、苹果酸的含量较高，有机酸随着鲜叶嫩度下降而减少，福鼎种的含量较低而黄金桂的含量最高，红茶中有机酸含量最高[1]。黎爽等建立了白茶中8种有机酸的HPLC方法，检测结果显示，乙酸是白茶中的主要有机酸，有机酸总量随着鲜叶等级的降低呈下降趋势[13]。赵和涛研究表明，红茶经过萎凋、揉捻、发酵等加工工序后，有机酸总量呈增长趋势，如水杨酸等有机酸，鲜叶中含量为29.60%，萎凋叶中含量为 32.21%，发酵叶中含量为43.82%，直至干燥时才有所降低[14]。谢娇枚等对祁门红茶进行品质分析发现，在长时间的存放过程中，祁门红茶的酸类物质总量增加明显，但各有机酸组分含量均有所改变，如草酸、乙酸等物质含量显著增加，而柠檬酸明显降低，使得茶汤滋味变酸且口感变差[15]。

目前，有关福鼎大白和中茶108品种鲜叶在不同生长期内有机酸含量的变化尚未见报道，本研究通过优化色谱条件，建立了采用高效液相色谱法检测茶叶中10种有机酸的测定方法，分析比较了福鼎大白和中茶108品种鲜叶在不同生长期内有机酸含量的变化规律，为茶叶加工工艺优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

材料均采自湖北省农业科学院果树茶叶研究所金水基地茶园，于2016年4月，根据不同茶树品种萌动期20 d后每隔一段时间采摘中茶108和福鼎大白2个茶树品种的新梢部分，先进行微波杀青，然后80 ℃烘干固样，磨碎后装入铝箔袋，低温储藏。不同采摘日期见表1。

H3PO4(色谱纯)，天津科密欧化学试剂公司；KH2PO4(分析纯)，阿拉丁试剂；草酸、奎尼酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗坏血酸、没食子酸标准品，源叶生物有限公司。

1.2 仪器设备

Waters 2695高效液相色谱仪，2998 PDA检测器；Milli-RO PLUS 30纯水机，法国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 有机酸标准溶液配制 分别称取草酸、奎尼酸、酒石酸、苹果酸20 mg，乳酸10 mg，柠檬酸、琥珀酸、莽草酸20 mg，抗坏血酸10 mg，没食子酸20 mg至10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度配制成混标储备液。混标中上述各标准品的浓度分别为2.0、2.0、2.0、2.0、1.0、2.0、2.0、2.0、1.0、2.0 mg/mL。分别量取混标溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm滤膜过滤后，得到不同浓度的有机酸混合标准品工作液。

表1 茶树品种及生长期对有机酸含量影响的试验设计

1.3.2 样品前处理 称取3.0 g磨碎茶于锥形瓶中，用 450 mL 纯净水冲泡，在沸水浴锅中浸提45 min，抽滤至 500 mL 容量瓶中，冷却后定容，用0.22 μm的膜过滤，分析有机酸含量。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：Atlantis T3 Column(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相：0.02 mol/L磷酸二氢钾(用磷酸调pH值至2.8)，流速为0.6 mL/min，进样量10 μL；紫外检测器波长210 nm。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测有机酸色谱条件的确定

2.1.1 检测波长的选择 本研究采用二极管阵列检测器(DAD)进行检测，混合标准品进样后对各有机酸的DAD图谱进行分析：在190～400 nm波长范围内，有机酸的吸收强度基本呈现先上升而后下降趋势，发现在210 nm处均有较大吸收峰，且基线稳定、噪音小。因此，确定检测有机酸的波长为210 nm。

2.1.2 流动相浓度、流速、pH值选择 磷酸盐缓冲溶液是最典型适用的洗脱液，在紫外区几乎无吸收，常作为有机酸测定的流动相[13]。本试验以磷酸二氢钾为流动相，考察了0.02、0.05、0.1、0.2 mol/L 4个不同浓度对有机酸混合标准品进行分离，发现出峰时间和分离度无明显变化(图1)，但是高浓度磷酸盐容易在仪器和色谱柱中结晶析出，因此，确定采用0.02 mol/L磷酸二氢钾为流动相。

2.2 标准曲线绘制与线性范围考察

将各有机酸标准试剂分别配成单一的标准溶液，在同一色谱条件下分别进样，确定每种有机酸的保留时间，根据保留时间定性。然后将不同浓度的有机酸单标混合成混标溶液，从低浓度到高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每个样平行进样3次)。按试验结果绘制各有机酸的标准曲线，以色谱峰面积为横坐标(X)，有机酸浓度为纵坐标(Y)，计算标准曲线方程(表2)。10个有机酸峰面积和浓度的相关系数在0.991 8～0.999 6之间，在一定的浓度范围内线性关系良好。

表2 有机酸标准曲线及精密度分析

2.3 方法回收率

选择108-1样品作为加标基质，重复添加3次，10种有机酸的加标回收率为95.33%～101.42%(表3)，表明该处理样品的方法具有较高的回收率，适合对茶叶中有机酸检测分析。

2.4 样品中有机酸含量

使用优选的色谱条件对20个茶叶样品分别进行检测，不同茶树品种不同生长阶段有机酸含量见表4。从表4可以看出，共检出10个有机酸组分，中茶108、福鼎大白2个品种样品的有机酸总量的平均值相近，在生长期内均呈先增加后减少的趋势，但中茶108样品在60 d时有机酸总量最高，为 57.98 g/kg；福鼎大白样品在30 d时有机酸总量最高，为 68.55 g/kg。中茶108、福鼎大白2个品种在不同生长期奎尼酸、没食子酸、柠檬酸平均含量最多，分别为20.24、8.66、5.68 g/kg，分别占有机酸总量的43.81%、18.75%和 12.29%。乳酸含量最低，尤其是在大部分福鼎大白样品中未检出。奎尼酸、莽草酸在生长期内与有机酸总量的变化趋势含量为 46.21 g/kg， 以奎尼酸、没食子酸、柠檬酸平均含量较一致，而苹果酸与抗坏血酸在生长期内呈持续减少趋势，草酸相对稳定，其他有机酸变化无明显规律。

表3 有机酸回收率试验

3 结论

本试验对茶叶中有机酸的检测条件进行了优化，确定了以0.02 mol/L磷酸二氢钾(pH值2.8)为流动相，Atlantis T3 Column为色谱柱，10种有机酸，即草酸、奎尼酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、莽草酸、抗坏血酸、没食子酸在 210 nm 处得到完全分离。对不同品种茶叶在不同生长期阶段的有机酸进行了检测分析，结果表明，中茶108和福鼎大白品种鲜叶含有的有机酸种类无明显差异，10种有机酸均有检出。样品各自的有机酸总量可达到22.12～68.55 g/kg，平均含量为 46.21 g/kg， 以奎尼酸、没食子酸、柠檬酸平均含量较高，分别为20.24、8.66、5.68 g/kg。有机酸是茶叶品质成分的重要组成部分，与茶叶品质的相关性还未开展系统研究。不同茶树品种、不同生长期的有机酸种类和含量均有一定差异，因此，今后要明确各种有机酸组分对茶叶品质的影响，有针对性地选择适宜的茶树品种，在最佳生长期内采摘鲜叶进行加工，为茶叶品质的提高提供理论依据。

表4 不同茶树品种在不同生长阶段的有机酸含量

注：ND表示未检出。