膝骨关节炎大鼠敏化穴区肥大细胞 超微结构的电镜研究*

秦萍萍，丁 宁，刘潇潇，王巧侠，胡嘉同，许艺元，李志刚

(北京中医药大学，北京 100029)

腧穴是脏腑、经络气血输注出入于体表的特殊部位，是针灸治疗的主要施术部位。对腧穴的形态结构、功能及其发挥作用的物质基础研究一直是针灸学科研工作的研究热点，备受人们关注。腧穴是个体化的、动态的、敏化态的体表反应部位，其大小和功能强弱随机体功能变化而动态变化，腧穴在生理状态下以“沉寂”为主，而在病理状态下或受到外界刺激时表现为“激活态”，其反应疾病和治疗疾病的功能都将大大增强，机体由生理到病理的转变，实现了腧穴敏化过程[1-3]。敏化态腧穴是与疾病过程相关的体表特定的敏感部位，对于疾病的诊断和治疗均有十分重要的意义。目前相关研究主要集中于腧穴敏化的机制[4-5]、生物物理特性[6]和敏化腧穴的客观成像[7-9]。

肥大细胞(Mast cell，MC)主要分布于真皮及皮下结缔组织，大多分布在靠近血管的地方。MC在经络循行线上相对集中[10]，在穴区数量较非穴区为多[11]，针刺可引起穴区MC数量增多，MC脱颗粒释放腔内物质产生针刺效应[12],此外敏化穴区MC聚集，脱颗粒率升高[5，13]。由此可知，MC是穴区重要的组织形态学组成部分，是腧穴敏化及针刺效应发挥的关键因素之一。既往对敏化穴区MC的形态学研究较少，尤其是对超微结构的观察相对不足，鉴于此，本研究以膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)大鼠为研究模型，采用透射电镜技术，观察鹤顶、委中穴在敏化过程中穴区局部MC的超微结构改变，对胞内致密颗粒占比进行定量分析，以探讨腧穴敏化的MC机制及敏化穴区MC超微结构改变的意义，为临床选穴治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用清洁级SD雄性大鼠18只，随机分为正常组、生理盐水组和模型组，每组各6只，体质量(155±5)g。实验动物由北京斯贝福生物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0002。实验动物饲养于北京中医药大学屏障环境动物室，实验前适应性喂养1周，温度为(23±1)℃，12 h光照，湿度45%，自由进食及饮水，排除饮食、环境等因素对实验动物产生的影响。

1.2 实验仪器与主要试剂

1.2.1 实验仪器 全波长扫描酶标仪(美国Thermo公司，型号：Multiskan GO)；低温高速离心机(美国Beckman 公司，型号：ALLEGRA X-15R)；超薄切片机(德国Leica公司，型号：ULTRACUT、UCT/UC6)；透射电子显微镜(美国FEI公司，型号：TECNAI SPIRIT)。

1.2.2 主要试剂 乌拉坦(美国Sigma公司，货号：U2500),戊二醛(美国Solarbio,货号：p1126),0.1MPBS(美国Gibco公司，货号：10010023),单碘乙酸盐(美国Sigma公司，货号：I4386),3%醋酸铀、枸橼酸铅、1%锇酸、50%、75%、90%、100%乙醇、环氧丙烷、Epon812包埋剂、IL-1β、CTX-Ⅱ试剂盒(北京欧北生物科技有限公司)。

1.3 模型制备

SD大鼠适应性饲养1周后，正常组相同饲养条件下不做任何处理。参考文献[14]并改进，模型组于实验第0天，将3 mg单碘乙酸盐(MIA)溶于50 μL无菌生理盐水溶液，通过髌下韧带注射至双侧膝关节腔内，建立MIA诱导的大鼠实验性KOA动物模型。生理盐水组大鼠双侧膝关节注射50 μL无菌生理盐水溶液作为假阳性对照。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 组织取材 造模后14天，20%乌拉坦5 mL/kg行腹腔注射法麻醉，采用内眦取血法，收集全血后静置30 min，4℃、3 000 r/min离心15 min，分离后取上清液，-80℃冰箱冷冻备用。参照全国针灸学会实验研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”选取鹤顶穴(EX-LE2)、委中穴(BL40)两个穴位，局部穴区剃毛、消毒后取皮肤及皮下结缔组织，规格为1 mm3，置于1.5%戊二醛中4℃固定待检。

1.4.2 检测方法 应用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中IL-1β、CTX-Ⅱ水平，检测过程严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4.3 透射电镜观察 将所取组织置于1.5%戊二醛中4℃固定2 h，0.1MPBS洗涤2次，1%锇酸4℃后固定2 h，0.1MPBS洗涤2次，梯度乙醇脱水，无水乙醇∶环氧丙烷(1∶1)脱水10 min，环氧丙烷脱水10 min，浸透、Epon812包埋、聚合。超薄切片，3%醋酸铀与枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组ELISA法检测结果比较

ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平，结果显示模型组大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平均高于正常组与生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)；生理盐水组与正常组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组MC超微结构观察比较

透射电镜下，各组大鼠结缔组织MC呈圆形或椭圆形，胞膜表面可见长短不一的绒毛状突起。核膜内侧有异染色质分布，核仁未见。胞核因受颗粒挤压而变形，呈不规则状。3组大鼠委中穴及正常组和生理盐水组鹤顶穴穴区MC胞膜完整，胞质中充满大小不等的颗粒，颗粒表面光滑，无明显皱缩，电子密度较高，分布均匀，未见明显脱颗粒特征；模型组鹤顶穴穴区MC内颗粒密度较低，颗粒外可见单位膜包裹，根据其密度可分为高密度颗粒、中等密度颗粒和低密度颗粒，但在密度高低的分类上没有严格的标准。MC周围可见有颗粒脱出，形态结构与胞浆内颗粒无明显区别。颗粒间膜或颗粒与细胞膜融合形成脱颗粒管道，内容物肿胀变大，通过管道释放至胞外，同时伴电子密度降低，呈分散的细小致密点，甚至为网状或泡沫状外观。颗粒释放后膜结构重新闭合，出现边缘空隙或空泡样结构，分别称为部分脱颗粒和完全脱颗粒。见封三彩图1。

表1 各组大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ的 水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05,**P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.3 各组大鼠不同穴区MC内致密颗粒占比比较

参考文献[15-16]并改进，透射电镜下由2名独立的研究员观察各组大鼠不同穴区各20例MC，分析胞浆颗粒密度，计算较高密度颗粒占总颗粒的百分比。结果显示模型组鹤顶穴穴区MC胞内致密颗粒占比显著下降，与正常组及生理盐水组同穴比较差异均有统计学意义(P<0.01)，说明模型组鹤顶穴穴区MC脱颗粒；模型组委中穴穴区MC胞内致密颗粒占比无明显变化，与正常组及生理盐水组同穴比较差异均无统计学意义(P>0.05)，说明模型组委中穴穴区MC未发生明显脱颗粒。正常组与生理盐水组同穴比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠相关穴区MC胞内致密颗粒 占比比较

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

腧穴与经络、脏腑相关联，是疾病的反应点和治疗的刺激点[17]。敏化态腧穴可反映疾病，其对于治疗刺激的高敏感性反应对疾病的治疗具有更高效的作用，因此对腧穴敏化现象规律的把握，可更加全面准确地用于指导临床，提高疗效。MC与腧穴敏化密切相关，鉴于此,本研究聚焦于穴区的重要物质基础——MC，研究机体由生理到病理状态下，特定穴区MC超微结构改变，以期能更好的认识和理解腧穴敏化的含义。

KOA是一种以关节软骨退行性变及骨质增生为特征的慢性关节病，属于中医“痹症”的范畴，为经络病的代表之一。研究表明针刺可有效缓解关节疼痛，改善运动障碍，在世界范围内得到广泛应用[18-19]。针刺治疗KOA时首选膝关节周围腧穴，其中鹤顶穴和委中穴的使用频次较高[20-21]。腧穴可反应疾病和治疗疾病,疾病的常见治疗用穴往往是疾病在体表的重要反应点，因此本研究选取鹤顶穴和委中穴为研究对象，以期能更好的观察敏化腧穴MC超微结构改变的特点。

IL-1β与KOA密切相关，可介导软骨基质降解过程中多种酶的产生，进而促进基质降解和关节软骨破坏，CTX-Ⅱ为软骨变性时的重要产物。研究表明：IL-1、CTX-Ⅱ可辅助早期KOA的诊断，且其在血清中的含量可反映疾病的程度；不同严重程度KOA患者血清中IL-1β、CTX-Ⅱ含量有明显差异[22-25],因此本项研究选取ELISA法检测血清中这两种物质的水平，以此评价KOA大鼠模型是否制备成功。实验研究结果显示，模型组大鼠血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平均显著高于正常组与生理盐水组，表明KOA模型制备成功；生理盐水组与正常组血清IL-1β、CTX-Ⅱ水平无明显差异，可作为假阳性对照，以排除因注射对大鼠产生的影响。

透射电镜显示，模型组鹤顶穴穴区MC脱颗粒，致密颗粒占比显著下降，从微观水平确认了腧穴的敏化特性，即机体由生理转变为病理状态时腧穴实现了从“静息态”到“激活态”的转变；同组委中穴MC超微结构未见明显改变，表明特定疾病状态下的腧穴敏化具有腧穴特异性。本研究中鹤顶穴和委中穴敏化的差异与目前针灸治疗KOA的穴位选择相一致(鹤顶穴使用频次高于委中穴)[26-27]。敏化态腧穴可更好的反应和治疗疾病，因此对疾病敏感反应较高的腧穴在临床实践中使用较多，本实验结果与既往研究均表明鹤顶穴对KOA的特异性相对较高。腧穴敏化与疾病相关并具有腧穴特异性，提示敏化与否可能是临床选穴的重要依据，敏化态腧穴可能对疾病有更好的治疗效果，值得进一步深入研究。

本研究通过观察KOA大鼠病变局部穴区MC超微结构的改变，从微观水平及客观形态学上证明MC参与腧穴敏化，具体表现为特定穴区MC脱颗粒，这可能是腧穴敏化在细胞层面的重要机制之一。研究表明[28-29]成熟MC颗粒在形态上的区别与组成相关，不同程度的脱颗粒可以反映颗粒的快速或逐渐释放以及同一过程的不同阶段，也可以表示不同介质定向分选和释放的结果。本研究结果显示大鼠皮肤MC颗粒未见特殊超微结构，脱颗粒分泌不同密度颗粒，提示敏化穴区MC释放物质类型可能与电子密度的高低有关，但具体关系尚不清楚。腧穴敏化过程中MC脱颗粒释放5-HT和HA[5]，5-HT和HA可进一步激活MC，促进其连续脱颗粒[30-31],此外5-HT和HA具有调节血管、改善微循环、引发炎症反应和参与神经系统功能活动等作用[32-34]，进而在神经-内分泌-免疫网络系统之间产生交叉作用，发挥生物学效应。本研究结果提示MC可能在腧穴敏化中扮演始动因素，腧穴敏化可能涉及包括微血管[35-36]、细胞和分子在内的多个层次水平，值得进一步深入研究。