百宜黑鸡PRLR基因多态性对产蛋性能的影响

吴松成， 韩 雪， 陈 林， 伍革民， 粟朝芝， 朱丽莉， 陶宇航

(1.贵州省畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005； 2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵阳贵州 550025)

催乳素(prolactin，PRL)是由腺垂体催乳素细胞合成和分泌的一种肽类激素，主要作用于动物的性腺和乳腺，催乳素与其受体(prolactin receptor，PRLR)结合后作用于靶细胞，调节繁殖相关激素的分泌，促进基因表达[1-3]。利用PRLR基因的作用机制，将其作为影响动物繁殖性能的候选基因有着重要意义。近年来，越来越多的研究者对催乳素受体基因进行大量报道，刘远等报道，PRLR基因的优势基因型个体能够显著提高大白猪的窝产仔数[4]；张陈华等研究指出，PRLR基因的多态性对圩猪和定远猪的产仔数有一定影响[5]；Tomas等发现，PRLR基因外显子突变能够显著影响猪的排卵率和仔猪存活率[6]；Chu等认为，PRLR基因与羊的产羔数相关[7-8]。但是以上的研究均是对家畜的研究报道，对于家禽的研究甚少。洪坤月报道，PRLR基因多态性对鸡的早期平均蛋质量有一定的影响，而对开产日龄、蛋型指数、早期产蛋量等影响不显著(P>0.05)[9]。百宜黑鸡是贵州省的优良地方品种，但由于近年来外来品种的引进，加之农户的粗放型饲养，人为因素过强地干预选育，百宜黑鸡品种资源岌岌可危。本试验以百宜黑鸡为研究对象，以期寻找有效的分子遗传标记，为该品种进一步的开发利用、保种等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

百宜黑鸡由贵州省贵阳市乌当区百宜乡贵州农农农生态农业开发有限公司的种鸡场提供。随机抽取同一日龄、相同饲养管理水平的95羽百宜黑鸡鸡翅静脉采血5 mL/羽，EDTA抗凝，放冰盒带回实验室，-20 ℃冰箱保存备用，用于基因组DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 试验采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]分别对95羽百宜黑鸡血液中基因组DNA抽提，并用Thermo Fisher微量紫外分光光度计对所获得的DNA进行浓度和纯度测定，1.0% 琼脂糖凝胶检测其完整性。

1.2.2 引物设计及PCR扩增 根据GenBank发布的家鸡PRLR基因序列(登录号：NC_006127.4)，利用引物设计软件Primer 5.0对鸡PRLR基因设计2对特异性引物，分别对外显子3(PRLR-1)和外显子6(PRLR-2)进行扩增，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，引物信息见表1。PCR扩增反应采用30 μL体系：上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix 14 μL，双蒸水9 μL。反应程序：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性40 s，退火35 s(退火温度详见表1)，72 ℃延伸40 s，32个循环；72 ℃终延伸10 min。

表1 百宜黑鸡PRLR基因扩增引物详细信息

1.3 数据处理

利用Excel 2007对数据进行分类统计，DNAstar进行序列分析比对，用SPSS 18.0中GLM模型对不同基因型与产蛋性能间的关联性进行相关分析，结果以“平均值±标准差”体现。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测

以百宜黑鸡基因组DNA为模板，分别对2对引物进行PCR扩增，产物用1.2%琼脂糖凝胶检测，结果发现，目的条带与预期结果一致，且引物特异性良好，PCR产物无须纯化可直接用于测序(图1)。

2.2 PCR产物测序及序列分析

根据目的片段扩增结果，将PCR产物全部送往北京诺赛基因组研究中心有限公司进行直接测序。测序结果经DNAstar拼接并与GenBank发布的家鸡PRLR基因序列进行校正、比对，结果在试验群体的PRLR基因中发现只存在1个SNP位点(图2)，在百宜黑鸡PRLR基因外显子3的36 bp位置发生了C/T突变(36C/T)，然而外显子6区域并未找到突变位点。

2.3 百宜黑鸡PRLR基因遗传特性分析

测序结果经序列对比发现，在试验群体的PRLR基因中找到了1个SNP，根据这个SNP位点将其对应的纯合子和杂合子命名为CC型和CT型。根据表2统计的结果可知，该位点对应的基因型CC基因型为优势基因型(0.957 9)，等位基因C为优势等位基因(0.978 9)。χ2适合性检验表明，该基因座的位点不处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)；PIC=0.041 7<0.25，属于低度多态。

表2 百宜黑鸡PRLR基因多态位点基因型频率及等位基因频率

2.4 PRLR基因与产蛋性能关联分析

根据SNP分型的结果，对不同基因型与产蛋性能间的关联性进行分析，百宜黑鸡PRLR基因36C/T位点与产蛋性能的显著性关系分析结果如表3所示，由表3可知，任何一种基因型与总蛋个数以及蛋均质量之间均不呈显著关系(P>0.05)。

表3 PRLR基因多态位点与肉质性状关联分析

3 讨论与结论

由于生产性能直接决定着经济效益，因此对养殖户或者育种家来说，在追求动物快速增长的同时更加注重其生产性能。王健等研究表明，鹅PRLR基因的表达受PRL基因的调控[10]；高天等研究表明，PRLR基因多态性极显著影响嘉兴黑猪的总产仔数、产活仔数、死胎数和初生均质量(P<0.01)[11]；孙延晓等研究发现，PRLR基因对猪的平均窝产数有影响[12]；洪月坤报道，PRLR基因外显子3多态性对鸡的产蛋性能无影响[9]。由此可见，不同的物种或品种得出的结论是不一致的。本研究以百宜黑鸡为研究对象，在试验群体的PRLR基因的外显子3发现了1个SNP，χ2适合性检验表明，该基因座的位点不处于Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)，这可能是抽样误差、样本数较少造成的，也有可能是人工过度选育结果所致。将该突变位点与总蛋数和平均蛋质量进行显著性分析发现，该位点的任何一种基因型对这2项生产数据均不显著，这一结果与前人研究结果[9]有一定的相似之处，但尚不清楚是品种原因还是基因特性，因此，笔者所在课题组今后将会加大样本数量和鸡品种进行进一步验证。本试验结果为后期原核或真核表达载体的构建提供了理论依据，对百宜黑鸡品种的开发利用、保种选育提供了理论资料。