饮酒与颅内动脉瘤关联的孟德尔随机化研究

刘新志　吴新龙　许敏华等

[摘要]目的 探讨饮酒与颅内动脉瘤（inlracranial aneurvsm，TA）发病的关系。方法 选取本院接诊的421例未破裂IA（unruptured intracranial aneurvsm，UIA）患者为观察组和425例非IA患者作为对照组。收集研究对象的一般人口学情况、病史、行为因素和体格检查，并采集外周血3ml进行遗传易感性检测。采用孟德尔随机化方法（mendelian random-ization，MR），以乙醇脱氢酶-1B基因（alcohol dehydrogenase-1B，ADHIB）的功能性突变点rs1229984作为工具变量，分析饮酒与UIA的关系。结果 ADH1B（rsl229984）的基因型在不同的年龄、性别、体型、糖尿病史、高血压史、吸烟的人群中的分布差异无统计学意义（P>0.05）；基因型变异与UIA的发生比较差异无统计学意议（P>0.05）；是否饮酒、不同饮酒量人群中基因型的分布差异有统计学意义（P<0.05）。因而rs1229984符合作为工具变量的条件。应用Logistic回归模型分析，结果显示是否饮酒、适量饮酒及过度饮酒与UIA无相关关系（OR=0.95～1.18，P>0.05）；MR法分析结果显示与不饮酒相比，饮酒、适度饮酒、过度饮酒与TA也无相关关系（OR=0.26～4.01，P>0.05）。结论 饮酒与TA的发生之间不存在具有统计学意义的关联。

[关键词]脑动脉瘤；饮酒；乙醇脱氢酶-1B基因；孟德尔随机化

中图分类号：R651.12 文献标识码：A 文章编号：1009-816X（2018）03-0177-134

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2018.03.002

颅内动脉瘤（Intmcranial aneurysm，TA）为脑动脉血管的球囊性扩张膨胀，其发生破裂后可造成50%患者死亡，同时30%的幸存者留有严重的后遗症。迄今为止，尚无有效的TA破裂预防手段，对TA的治疗也以有创的手术夹闭和栓塞为主，且手术过程伴发风险。因此，了解TA的病因和发病机制是解决TA问题的关键。TA的病因复杂，目前其发病机制尚未完全阐明。吸烟、男性、高血压等多种因素均能增加TA的形成。然而，饮酒与TA发病的关系尚未明确。此外，传统的观察性病因研究时，由于混杂偏倚的困扰无法排除，同时暴露和结局的时间顺序也常被混淆，常常造成研究结果的不一致性并受到质疑。为解决上述问题，Katan提出了孟德尔随机化（Mendelian Randomization，MR）设计。MR将基因作为待研究暴露因素的工具变量（instrumental variable），用基因型和疾病的关联效应模拟暴露因素对疾病的作用，由于等位基因在配子形成时遵循随机分配的孟德尔遗传规律，因此基因与疾病的关联不会被传统流行病学研究中的混杂和反向因果关系所歪曲，进行因果推断时具有独特的优势。因此，本研究采用MR设计分析饮酒与TA的关系，为进一步阐明TA的发病机制提供线索。

1资料与方法

1.1一般资料：选择2015年1月至2016年12月期间，在湘雅医院神经外科和神经内科招募就诊的421例TA未破裂（unnlDtured intracranial aneurvsm，UIA）患者为观察组（共450个颅脑动脉瘤）和425名非TA患者作为对照组。TA患者纳入标准：（1）经CTA或DSA确诊TA的患者；（2）TA尚未破裂；（3）汉族；（4）同意参与本研究。TA患者排除标准：（1）脑动静脉畸形伴IA；（2）梭形或夹层脑动脉瘤；（3）单纯闭塞载瘤动脉的动脉瘤；（4）曾经出现过因TA破裂或不明原因导致的颅内出血；（5）存在沟通困难无法完成问卷者。对照组的纳入标准：（1）经CTA或DSA确诊的非TA患者；（2）颅脑无其他器质性病变；（3）患者同意参与本研究；（4）汉族。对照组排除标准：（1）出现过不明原因的颅内出血；（2）存在严重慢性病或不能配合完成问卷者。

1.2方法：所有研究对象需接受现场问卷调查和体格检查。问卷调查采用自行设计的问卷，内容包括社会人口学情况，如年龄和性别；行為危险因素如吸烟和饮酒；疾病现患和家族史，如高血压和糖尿病现患史和服药情况，TA家族史等。体格检查主要包括身高、体重和血压。

采集研究对象外周血3ml至EDTA抗凝管中，-20℃保存，于48h内使用Qiagen试剂盒提取DNA并进行rs1229984多态性检测，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。该位点是位于染色体4q22的乙醇脱氢酶-1B基因（Alcohol Dehvdrogenase-1B，ADH1B）的突变位点，A等位基因的变异能够影响机体的乙醇氧化能力和饮酒行为，因此本研究使用ADH1B（rs1229984）作为饮酒暴露的工具变量，分析饮酒与TA发生的关系。SNP分型采用多聚酶链反应.限制性片段长度多态性（PCR-RELP）法测定：引物为5-agaaaea-caattteaggaatttgg-gt-3和5-actoaccacgtggtcatctgcg-3；在PCR反应条件为95℃预变性2min，经30个循环，每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃保温7min；PCR产物经限制性内切酶消化，并通过3%琼脂糖凝胶分离后行DNA测序分析。

饮酒指每周饮酒2次及以上或达到50ml，并持续1年以上者。“适量饮酒”是指每天饮酒男性不超过24克纯酒精（相当于每周168克），女性不超过12克纯酒精（相当于每周84克）。根据公式换算被访对象的每周饮用酒精量（饮用酒精量：饮酒量（毫升）×酒度数×0.8（酒精密度）），将饮酒者划分为适量饮酒与过度饮酒（男性≥168克/周；女性≥84克/周）。吸烟指连续吸烟6个月及以上，每日至少一支。体质量指数（BMI）=体重（kg）/身高（m）²，BMI<18.5kg/m²为低体重，BMI：18.5～23.9kg/m²为正常体重，BMI：24.0～27.9kg/m²为超重，BMI：≥28kg/m²为肥胖。

1.3统计学处理：所有统计均采用Stata 12.0版软件进行分析，计量资料使用（x±s）表示，组间比较采用方差檢验；计数资料使用频数和率表示，组间比较用卡方检验，趋势分析采用趋势性卡方检验；采用多因素Logistic回归分析饮酒与TA的关系；用孟德尔随机化法，以rs1229984作为工具变量，建立回归模型，得到的结果采用bootstrap法与多因素Logistic回归分析结果进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况比较：两组在年龄、性别、体型、糖尿病史和是否饮酒的分布上差异无统计学意义（P>0.05）。观察组较对照组高血压、吸烟和过量饮酒者更多（P<0.05）。ADH1B基因（rs1229984）不同基因型在两组的分布无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 ADH1B基因（rs1229984）与饮酒及其他混杂因素的关系：ADH1B基因（rs1229984）的基因型分布情况在不同的年龄、性别、体型、糖尿病史、高血压史、吸烟的人群中差异无统计学意义（P>0.05）。ADH1B基因rs1229984基因型在是否饮酒、不同饮酒量人群中的分布不完全相同，差异具有统计学意义（P<0.05）。与不饮酒者相比，饮酒者、过量饮酒者rsl229984更可能为GG基因型，见表2。

2.3孟德尔随机化分析饮酒与TA的关系：在使用Logistic回归控制混杂因素后，与不饮酒相比较，饮酒与否、适量饮酒及过度饮酒与TA的发生均无相关关系OR分别为1.00（95% CI：0.68，1.05），0.95（95%CI：0.79，1.00）和1.18（95% CI：1.00，2.01）。将rs1229984基因型作为饮酒行为的工具变量，结果显示与不饮酒相比，饮酒、适度饮酒、过度饮酒与TA亦不存在具有统计学意义的关联OR分别为1.45（95%CI：0.18，10.98），0.41（95%CI：0.26，1.01）和4.01（95%CI：0.99，11.07）。采用bootstrap重复估计的方法，比较Logistic回归模型与工具变量模型，两种方法获得的关联OR值在估算饮酒与否、适度饮酒、过量饮酒与TA的关联中的差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

3讨论

ADH1B是人体乙醇代谢中最主要的同工酶，其基因的多态性可直接影响饮酒行为，当rs1229984携带GG基因型时，个体ADH1B的表达量相对于野生型表达量减少约40倍。因此，乙醇进入体内后代谢为乙醛的速度降低，饮酒后更容易耐受，常常饮用更多的酒。本研究亦观察到rs1229984基因型与饮酒行为相关。不同的性别、年龄、高血压史、糖尿病史、BMI和吸烟者中基因型分布的差异无统计学意义，因此rs1229984基因型与研究中已知的混杂无关。此外，本研究也显示，rs1229984基因型与TA的发生并不存在直接的统计学意义的关联。基于以上情况，rs1229984基本满足工具变量的要求，为了更好的控制混杂，本文选取该基因作为工具变量，采用MR法探讨饮酒与TA的关联。了解TA的病因和发病机制是解决TA问题的关键。研究表明，饮酒可以引起中枢神经系统炎性及变性反应。在严重酗酒者中，长期大量的乙醇暴露后还可观察到细胞内ROS形成，血脑屏障内皮细胞受损、血管渗透性增加。因此饮酒与TA形成及预后的研究倍受关注。然而饮酒与TA的形成之间的关联存在一定争议：Kang通过比较367例UIA与18587例对照发现，颅内不同位置的TA，造成其形成的危险因素不完全相同，虽然总的TA形成与饮酒无关联，但是前交通动脉TA的形成与饮酒存在统计学关联（调整OR=2.54，P=0.01）。Juvela却发现饮酒或酗酒都与多发性TA的形成无显著统计学关联。本研究也未观察到TA与饮酒行为及饮酒量之间存在统计学关联，乙醇的摄入可能不会影响TA的形成，既往研究中观察到的饮酒者TA变大或破裂风险增加，可能是饮酒后一过性的血压增加并伴随血流动力的改变所致。本研究由于缺乏TA位置的数据，对于具体血管TA的形成与饮酒的关联还需要进一步研究。

与既往的研究相比，本文在讨论饮酒与TA的关联时，不仅考虑了饮酒与否还考虑了饮酒量与TA的关联。收集了患者的BMI、疾病史等数据，控制了已知的混杂因素。此外，最重要的是，本研究采用了孟德尔随机化设计，该设计在研究暴露与疾病的关联时，可避免研究结果被混杂和反向因果关系所歪曲，具有因果推断的独特优势。但本研究也存在缺点，如，没有讨论不同位置的TA与饮酒的关联；只选取了一个影响乙醇代谢的相关的ADH1B基因，而影响乙醇代谢通路的基因及多态性位点较多，可能存在基因多效性和交互作用。因此，在今后的研究中可选择多个基因联合作为工具变量将有助于进一步验证饮酒与TA的关联。

综上所述，本研究以ADH1B基因作为变量工具，采用孟德尔随机化法分析了饮酒行为与TA发生之间的关联，结果发现饮酒与TA的发生之间不存在具有统计学意义的关联。